Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур

• Автор: Чупикова, Наталия Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.23, 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Открытие стволовых клеток взрослого организма.

1.2. Строение костного мозга человека

1.3. Методы выделения ММСК костного мозга

1.4. Особенности морфологии и роста ММСК i vi

1.5. Экспрессия поверхностных маркеров.

1.6. Направленная дифференцировка ММСК.

1.7. Пластичность ММСК костного мозга

1.8. Иммунологические свойства ММСК
1.9. Возможности клинического применения ММСК на примере трансплантации биоматриксов костной ткани
1 Заключение.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований.
2.1.1. Культуральная посуда.
2.1.2. Приборы и оборудование.
2.1.3. Специальные среды и растворы.
2.1.4. Методы исследований
2.2. Результаты исследований.
2.2.1. Метод выделения ММСК костного мозга
2.2.2. Способность к формированию колоний i vi, митотический индекс и клеточный цикл
2.2.3. Подбор условий для долгосрочного культивирования ММСК.
2.2.4. Анализ ММСК костного мозга в динамике культивирования i vi
2.2.5. Анализ поверхностных маркеров, полученной популяции клеток
2.2.6. Способность к цитодифференцировке в клетки мезодермального происхождения.
2.2.7. Локализация ММСК i viv в организме мыши при внутривенном введении
2.2.8. Получение трехмерных трансплантатов костной ткани на основе ММСК костного мозга и кальцийфосфатного матрикса i
2.2.9. Гистологический и иммуногистохимический анализ полученных трехмерных трансплантатов костной ткани.
2.2 Гистологический и иммуногистохимический анализ ТТКТ, имплантированных в организм мыши
2.2 Влияние полученных трансплантатов костной ткани
на организм овец при остеосинтезе
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛ ЕДОВ АНИЙ.
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ММСК мультипотентные мезенхимные стромальные клетки ГСК гематопоэтические стволовые клетки
БМЕМНв среда Игла в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы
ЭМЕМЬв среда Игла в модификации Дюльбекко с пониженным
содержанием глюкозы
БВБ сыворотка плода коров
ФБС фосфатносолевой буфер Дюльбекко
РОйБ фактор роста тромбоцитов
РОБ фактор роста фибробластов
ЕвР фактор рост эндотелия
ИМБО диметил сульфоксид
НБА человеческий сывороточный альбумин
ВМХ изобутилметил ксантин
ЮР1 инсулиноподобный фактор роста
ТСРР1 трансформирующий фактор роста бета
ГАФДГ глицеральдегид3фосфатдегидрогеназа
МИ митотический индекс
КСП костный сиалопротеин
ОК остеокальцин
ОП остеопонтин
ТТКТ трехмерный трансплантат костной ткани ПЦР полимеразная цепная реакция
ОТПЦР полимеразная цепная реакция с применением стадии обратной транскрипции
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Зависимость дифференцировки ММСК костного мозга в трехмерных пористых структурах от концентрации клеток. Доклиническое изучение полученных биоимплантов в организме иммунодсфицитных животных и мелкого рогатого скота i viv. Публикации. По результатам диссертации опубликовано работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, статей в сборниках научных трудов. Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 3 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы 3 источников, из которых отечественных и 0 иностранных. Работа содержит таблиц, рисунков, 9 страниц приложений. Долгое время исследователи пытались найти ответ на вопрос о путях и способах регенерации органов и тканей живых организмов, в частности человека. В дальнейшем понимание механизмов регенерации могло иметь огромное значение для широкого практического применения в медицине и ветеринарии. Понятие стволовой клетки взрослого организма было впервые введено российским ученым Александром Максимовым в начале прошлого века г. На основе научных исследований в области гистогенеза крови и соединительной ткани удалось проследить основные этапы гистогенеза соединительных тканей и крови у различных животных, как в эмбриональном, так и постнатальном периодах. Выводы, сделанные им, свидетельствовали в пользу того, что все клетки крови развиваются из одного предшественника, который имеет вид малого лимфоцита. Им было высказано положение, что подобные предшественники, характеризующиеся чрезвычайно широкими дифференцировочными потенциалами имеются в тканях не только на эмбриональной стадии, но и во взрослом организме. Максимов впервые в отечественной науке использовал термин стволовая клетка 1. Однако примерно в то же время г. Н.ЗсЬпсМе к недифференцированным клеткам эпителия передних отделов кишечной трубки в ходе эмбриогенеза 8. Но, несомненно, заслугой Максимова является его предположение о стволовых клетках во взрослом организме. Открытие ММСК костного мозга принадлежит Александру Фриденштейну и относится оно к м годам го века. В году группой А. При помещении клеток костного мозга в диффузионную камеру, клетки также формировали костную ткань, но заселения клетками крови не происходило. Благодаря полученным результатам был сделан вывод об остеогенном потенциале клеток костного мозга, в отличии, например, от клеток эпителия, и подтверждено, что остеогенные предшественники костного мозга отличаются от предшественников клеток крови 9. Для доказательства того, что костный мозг содержит популяции клетокпредшественников костной ткани и клеток крови, был поставлен следующий эксперимент. Мышамгибридам поколения Б1 под почечную капсулу трансплантировался костный мозг родительской особи. Методом кариологического анализа было обнаружено, что образующаяся костная ткань образовывалась из клеток родительской особи, а гематопоэтическая ткань формировалась из клеток гибрида. Эти исследования подтвердили, что остеогенные и гематопоэтические клетки происходят из различных предшественников, также было показано, что гетеротопическая костная ткань самоподдерживалась и не заменялась клетками хозяина. Эти результаты позволяют классифицировать эти клетки как остеогенные стволовые клетки или ММСК , . В последующих экспериментах было установлено, что при эксплантации клеток кроветворных и лимфоидных органов с низкой плотностью на й день культивирования образовывались видимые невооруженным взглядом дискретные колонии фибробластоподобных клеток. Благодаря этим экспериментам удалось установить содержание этих клеток в различных органах и тканях организма в норме 23, при различных патологических состояниях и различных воздействиях на организм облучение, травма введение антигена, кровопотеря и т. Определяющим являлось установление клонального происхождения формирующихся колоний колониеобразующих клеток предшественников .