Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами

• Автор: Ясная, Анна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.23, 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

Кроме того, очень актуальной является проблема создания отечественного штамма продуцента рекомбинантной ПА из А. Нэ, поскольку все три известные на настоящий момент нуклеотидные и аминокислотные последовательности этого фермента запатентованы. Поэтому еще одной задачей стало клонирование патентночистого гена ПА из А. Пз и изучение свойств рекомбинантного фермента. Впервые пенициллинацилазная активность была описана японскими учеными в году 1. Авторы обнаружили, что мицелий iii и i способен превращать бензилпенициллин в фенилуксусную кислоту и некое вещество, названное авторами неницин, которое позже было индентифицированно, как 6аминопенициллановая кислота бАПК . Более детальные и тщательные исследования этого фермента относятся уже к м годам XX века. Именно в это время появляется большое число научных публикаций, посвященных изучению свойств и способов, а также перспектив применения данного фермента, причем, число научных статей, посвященных пенициллипацилазам, с каждым годом только увеличивается. Пспициллинацилаза ПА, пенициллинамидаза, КФ 3. ФУК и 6аминопенициллановой кислоты 6АПК рис. Рис. Реакция, катализируемая пенициллииацилазой. ФУК фенилуксусная кислота, 6АПК 6аминопенициллановая кислота
. I В. I i
О. V.i
. I.iii
Рис. Филогенетическое дерево пенициллинацилаз . Пеиициллинацилазная активность обнаружена в бактериях, дрожжах и низших грибах . В настоящее время IIА обнаружены более чем в различных бактериях. Па рисунке 2. ПАаз типа . Как видно из рисунка, наибольшее число этих ферментов встречается в протеобактериях. В зависимости от организма фермент может быть локализован как вне, так и внутри клетки. Для пенициллинацилаз тип II характерна локализация активного фермента в периплазматическом пространстве клетки. Внеклеточная экспрессия также встречается как у пенициллинацилаз V тип I, так и у
пенициллинацилаз в тип И. Физиологическая роль ПА до сих пор не ясна, не смотря на то, что этот фермент изучается уже болсе лет. Вероятнее всего ПА служит для утилизации амидов ароматических соединений в качестве источника углерода 8. В таблице 2. Таблица 2. Основные характеристики пеницилинацилаз из различных источников. ПенУ н. ПенУ н. Тип II i i ПснСт, цефалексин, цефалоглицин, цефалоридин н. ПА i i Пен0 н. Пен0 н. Тип III АтрПА Амп, цефалоглицин, цефадрин, цефалексин н. Пеиицилипацилазы относятся к рлактамным ацилазам и классифицируются по типу гидролизуемого субтрата на ферменты гидролизующие преимущественно пенициллин в, пенициллин V и ампициллин. I и тип II в соответствии с номенкулатурой, предложенной авторами . Ферменты, относящиеся к типу I преимущественно гидролизуют пенициллин V феноксиметилпенициллин, тип II пенициллин в бензилпенициллин. Позднее к этой классификации был добавлен тип III ферменты, отвечающие за гидролиз ампициллина Пааминобензилпенициллин 9,. Рис. Классическая номенкулатура лактамных ацилаз . Общая классификация рлактамных ацилаз по предпочитаемому ядру и соответствующим природным боковым радикалам обозначенным как в структуре ядер приведена на рисунке 2. ИЬ предпочтительный гидролиз алифатических амидов . Однако, позднее с помощью генноинженерных методов наличие генов ПА было подтверждено только в бактериях , . Ген ПА кодирует фермент в виде неактивного предшественника. Он состоит из 4 структурны элементов сигнального пептида, а и субъединицы и межсубъединичного спсйссра. Зрелый фермент, в случае ПЛ, представляет из себя гетеродимер общей массой кДа. Он состоит из двух субъединиц а массой кДа и кДа . Каталитический остаток ссрина находится на конце субъединицы . Посттрапсляционная модификация ПА является многостадийным процессом и была довольно хорошо изучена на примере фермента из . На первом этапе с помощью сигнального пептида происходит транспорт неактивног о белкапредшественника из цитоплазмы в периплазматическос пространство клетки, затем сигнальный пептид отщепляется. На заключительном этапе происходит выщепление спейсера с образованием активного гетеродимера , , . В клетках . Авторы показали, что необходим для образования сПА0 в активной форме.