Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани

• Автор: Шарифуллина, Светлана Загировна
• Шифр специальности: 03.00.23, 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 174 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,.

1.1. Стволовые клетки человека

1.2. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани

1.2.1. Жировая ткань

1.2.2. Фенотипическая характеристика ММСК жировой ткани, СО маркерный профиль

1.2.3. Потенциал дифференцировки ММСК жировой ткани.

1. Адипогенез.

2. Остеогенез.

3. Хондрогенез

1.3. Иммуномодуляторный эффект ММСК жировой ткани.

1.4. Перспективы применения ММСК жировой ткани

1.5. Заключение.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1.1. Оборудование.
2.1.2. Реактивы и расходные материалы.
2.1.3. Метод получения ММСК жировой ткани.
2.1.4. Морфологический анализ.
1. Микроскопия
2. Анализ митотического индекса.
3. Время цитогенерации
4. Оценка жизнеспособности
2.1. 5. Иммунофенотипирование.
2.1.6. Кариотипирование.
2.1.7. Анализ клеточного цикла
2.1.8. Дифференцировка ММСК жировой ткани.
1. Адипогенная дифференцировка
2. Остеогенная дифференцировка
3. Хондрогенная дифференцировка.
2.1.9. Молекулярный анализ полученных двухмерных структур, при направленной остео и хондродифференцировке. .
2.1 Иммуноцитохимия и иммуногистохимия
1. Иммуноцитохимия с использованием vi iv i i i.
2. Иммуногистохимия.
3. Специфическая окраска клеток.
2.1 Доклинические испытания с применением ММСК ЖТ.
2.1 Молекулярный анализ локализации ММСК ЖТ в организме экспериментальных животных по хромосоме
2.1 Метод получения трехмерных трансплантатов хрящевой ткани.
2.1 Доклинические испытания трансплантация ТТХТ на основе ММСК жировой ткани в организм иммунодефицитных мышей
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1 Метод выделения ММСК из жировой ткани.
2.2.2. Морфология и кариотип ММСК жировой ткани.
2.2.3. Анализ клеточного цикла
2.2.4. Иммунофенотипирование ММСК жировой ткани.
2.2.5. Дифференцировка ММСК жировой ткани.
2.2.6. Молекулярный анализ полученных двухмерных структур, при направленной остео и хондродифференцировке.
2.2.7. Доклинические исследования физиологического распределения и локализации ММСК ЖТ в организме мышей.
2.2.8. Создание трехмерных трансплантатов хрящевой ткани ТТХТ
2.2.9. Гистологический и иммуногистохимический анализ ТТХТ, полученных на основе коллагена и полимолочной кислоты.
2.2 Доклинические испытания трансплантация ТТХТ на основе ММСК жировой ткани в организм иммунодефицитных мышей
2.2 Иммуногистохимический анализ полученных ТТХТ после i viv теста.
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
4. ВЫВОДЫ.
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ
ВЫВОДОВ.
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
МСК мезенхимные стволовые клетки
ММСК мультипотентные мезенхимные стромальные клетки
ЖТ жировая ткань
КМ костный мозг
ММСК КМ мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга
ММСК ЖТ мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани
ГСК гемопоэтические стволовые клетки
ЭпСК эпидермальные стволовые клетки
ЭСК эмбриональные стволовые клетки
ТТХТ трехмерные трансплантаты хрящевой ткани
i фосфатносолевой буфер в модификации Дюльбекко
i буферный раствор на солях Хэнкса ii i i питательная среда в модификации Дюльбекко с низким содержанием глюкозы
ii i i i питательная среда в модификации Дюльбекко с высоким содержанием глюкозы
vi фетальная сыворотка плода коров
i i i раствор заменимых аминокислот
i сывороточный альбумин из крови человека
I Iiii комплекс инсулинтрансферринселен i Трансформирующий фактор роста бета
рЗ i 3 Трансформирующий фактор роста бета
I1 Iii 1 Инсулиноподобный фактор роста
ii колониистимулирующий фактор роста гранулоцитовмакрофагов i i основной фактор роста фибробластов V v i эндотелиальный фактор роста сосудов
фактор роста нервов
iiv i нейротрофный фактор, выделенный из головного мозга
ii i i i
IX ixi изобутилметилксантин
xi бутилированный гидроксианизол
ПЦР полимеразная цепная реакция
ОТПЦР полимеразная цепная реакция с применением стадии обратной транскрипции
ВВЕДЕНИЕ


Выявление основ данных механизмов позволило бы использовать клеточные ресурсы целенаправленно и усиливать естественный репаративный потенциал клеток. Открытие стволовых клеток и изучение их биологии позволило получить новые перспективы для более глубокого исследования процессов развития, дифференцировки, регенерации и лечения наследственных и дегенеративных заболеваний. Было выявлено, что эти клетки участвуют в поддержании гомеостаза и регуляции репаративных процессов в поврежденных органахтканях, в процессах обновления клеток крови и др. Первые данные об этих клетках появились в году, когда были опубликованы данные исследований русского ученого А. Максимова о том, что существует определенный тип клеток в костном мозге, участвующий в развитии и созревании клеток крови. Далее, с середины XX века, эти клетки стали использовать для восстановления гемопоэза после химиотерапии у пациентов с лейкозом и другими заболеваниями кроветворной и лимфатической систем злокачественного характера ,. В последствии эти клетки были названы гемопоэтическими стволовыми клетками ГСК, которые были обнаружены в дальнейшем в периферической крови взрослого человека и в пуповинной крови , , 0, 4, 0, 3. В настоящее время ГСК применяются в восстановлении кроветворной системы после проведения химиотерапии в лечении злокачественных и аутоиммунных заболеваний ,,9,1. В дальнейшем, в году ученым К. ЭпСК 3. Было выявлено, что ЭпСК расположены в основании волосяного фолликула и под эпидермисом на базальной мембране. Как было показано впоследствии, эти клетки способны восполнять утраченные клетки своей ниши и успешно применяются для восстановления кожного покрова при ожогах , , 0, 3, 3, 4. Возможность использования для заживления ран аутологичных собственных клеток кожи, выращенных i vi, была показана в году в работах . Дальнейшие исследования привели к разработке методов длительного культивирования и поддержания жизнеспособности клеток кожи фибробластов вне организма i vi. В году . Хейфлика 3, 4. В дальнейшем, были разработаны и оптимизированы различные методы выделения и культивирования клеток из дермы кожи. Однако лишь в году ученым К. ЭпСК, количество которых, как было показано позднее, с возрастом уменьшается 5, 1. Проведенные в дальнейшем многочисленные исследования показали, что эти клетки способны восстанавливать глубокие повреждения кожных покровов, особенно эффективно в сочетании с эквивалентом дермального слоя кожи, и способны активизировать спящие и восстанавливать поврежденные волосяные фолликулы 8, 7. В году русский ученый А. КМ. Эти клетки были названы стромальными клетками костного мозга СК КМ . В дальнейшем различные группы исследователей продемонстрировали, что эти клетки обладают способностью к дифференцировке i vi в различные типы клеток ,, , , , ,4,9,3, 8, 6, , 8, 6, 7 и были названы мезенхимными стволовыми клетками МСК. Известно, что организм взрослых млекопитающих, включая человека, состоит более чем из 0 типов клеток, развивающихся из различных зародышевых листков. Стволовые клетки присутствуют в различных тканях и органах на разных стадиях онтогенеза в период неонатального и постнатального развития. На ранних стадиях эмбриогенеза до стадии компактизации зародыша, 8 клеток все клетки зародыша бластомеры тотипотентны, т. На стадии образования бластоцисты, клетки внутренней клеточной массы сохраняют свойства ранних бластомеров и служат источником получения эмбриональных стволовых клеток ЭСК, i , , из которых ведут свое происхождение все органы и ткани. В процессе развития зародыша клетки подвергаются последовательной дифференцировке, которая ведет к их специализации 6, 2. Считается, что в результате этого процесса в тканях развивающегося эмбриона остается пул запасных недифференцированных тканеспецифичных клеток, названные мезенхимными стволовыми клетками МСК. Эти клетки способны сохраняться в организме человека в течение всей жизни. Способность их давать начало разным типам клеток и тканей организма называется мультипотентностью и является одним из основных характеристик всех МСК взрослого организма , , , , , , , , , , , 0, 4, 9, 2, 3, 4, 8, 0,6, 5,,6,8,0,6,0,7,7,8,3.