Развитие системы управления жилищной сферой городов России

• Автор: Круглик, Сергей Иванович
• Шифр специальности: 08.00.05
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 368 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ .
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОТРУБОЧЕК.
2.2. СВОЙСТВА ТУБУЛИНА .
2.3. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ ТУБУЛИНА
2.4. СВЯЗЫВАНИЕ ТУБУЛИНА С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЛИГАНДАМИ
2.5. САМОСБОРКА МИКРОТРУБОЧЕК
2.5.1. Общие свойства реакции и роль олигомера тубулина
2.5.2. Сборка микротрубочек описывается механизмом нуклеацииполимеризации
2.5.3. Промежуточные продукты при сборке
2.5.4. Роль ГГФ в сборке
2.5.5. Полярность микротрубочек .
2.5.6. Центры сборки микротрубочек
2.5.7. Регуляция сборки мшфотрубочек ионами кальция .
2.5.8. Влияние митостатиков на сборку микротрубочек
2.6. БЕЛКИ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С МИКРОТРУБОЧКАМИ
2.7. ВОЗМОЖНЫЕ ФУНКЦИИ МИКРОТРУБОЧЕК.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
3.1.1. Препаративные методы.
3.1.2. Аналитические методы.
3.2. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Стр.
3.2.1. Цитологические методы .
3.2.2. Иммунологические методы
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. ИССЛЕДОВАНИЕ СБОРКИ И РАЗБОРКИ МИКРОТРУБОЧЕК
I VI
4.1.1. Состав препарата микротрубочек и постановка задачи по выделению МАР
4.1.2. Термостабильность факторов и общий подход
к выделению МАР.III
4.1.3. Выделение белка МАР2 из гомогената мозга
4.1.4. Выделение белка I и нативного белка
МАР2 из препарата белков микротрубочек. .
4.1.5. Роль высокомолекулярных МАР в сборке и
их взаимодействие с микротрубочками . . .
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ СБОРКИ И РАЗБОРКИ МИКРОТРУБОЧЕК
I VIV .
4.2.1. Разработка метода экстракции клеток для выявления микротрубочек с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания
4.2.2. МАР2 входит в состав микротрубочек в культивируемых клетках
4.2.3. Гетерогенность цитоплазматических микротрубочек по чувствительности к деполимеризации охлаждением.
4.2.4. Связывание деполимеризованного тубулина с актином .
4.2.5. Сравнение действия колхицина и колцемида
на микротрубочки
4.2.6. Действие АТФ на деполимеризацию цитоплазматических микротрубочек .
4.2.7. Роль центриолей в стабилизации цитоплазматических микротрубочек .
Стр.
5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. РОЛЬ СБОРКИ И РАЗБОРКИ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МИКРОТРУБОЧЕК.
5.2. СВОЙСТВА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МАР И РЕГУЛЯЦИЯ ИМИ СБОРКИ МИКРОТРУБОЧЕК.
5.3. МЕХАНИЗМЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ СБОРКУ И РАЗБОРКУ МИКРОТРУБОЧЕК В КЛЕТКАХ.
6. В Ы В О Д Ы
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Если с и центром белка микротрубочек связан ГДФ, то он может принимать участие в качестве акцептора в реакции трансфосфорилирования переноса фосфата нуклеозидтрифосфата, находящегося в растворе, на нуклеотид, связанный с белком , i, . Донором фосфата в реакции трансфосфорилироВЭНИЯ СПОСОбеН СЛУЖИТЬ Не ТОЛЬКО ГТФ, НО И АТФ . Реакция трансфосфорилирования осуществляется не самим тубулином, а одной из нуклеозидцифосфокиназ, которая может быть отделена от тубулина методом полимеризациидеполимеризации , i, . Как мы покажем ниже, гидролиз ГТФ, происходящий при полимеризации тубулина, играет существенную роль в регуляции процесса сборки микротрубочек. , i, . i i. , . И 2 i . и Мп , а связывание нуклеотида к появлению сродства К ЭТИЛ металлам, i, i, . Таким образом, вероятно, что ГТФ связанный на Еучастке принимает участие в образовании связывающего центра. Характерным свойством тубулина, отличающим его от всех других клеточных белков, является способность к высокоаффинному связыванию колхицина и других растительных алкалоидов, обладающих митостатическим действием. Формулы некоторых митостатиков приведены на рис. I. Реакция связывания колхицина была использована как метод тестирования при выделении цитоплазматического тубулина. Рис. И др. При связывании с тубулином колхицин не претерпевает химических изменений i, , а . Связывание колхицина с тубулином сильно зависит от температуры оно практически полностью подавляется при 04С и оптимально при С i, . Существенно и это используется при анализе колхицинсвязывающей активности тубулина, что образовавшийся при С комплекс не распадается при понижении температуры. Подчеркнем, что способностью связывать колхицин обладает лишь нативный тубулин денатурация белка и даже его продолжительное хранение в водных растворах, не приводящее к заметному изменению вторичной структуры, полностью подавляют колхицинсвязывающую аКТИВНОСТЬ i . Vi . Такая нестабильность колхицинсвязывающей активности приводит обычно к. К нулевому моменту Времени . При этих условиях для связывания получают значения, близкие к I молю колхицина на I моль тубулина. Кинетика связывания колхицина с тубулином исследовалась в целом ряде работ, однако изза низкой стабильности тубулина получаемые данные сильно варьировали. Наиболее корректной, на наш взгляд, является работа ii . М. Хотя абсолютные значения констант, полученные в других работах, отличаются от приведенных выше см. Отметим, что с участком связывания колхицина на молекуле тубулина способны связываться и некоторые другие митостатики рис. I. Из них наибольшее употребление получили колцемид i, i, , ПОДОфИЛЛОТОКСИН i, И синтетический препарат нокодазол, ранее называвшийся онкодазолом . См. I. Не все митостатики, действующие на тубулин, связываются с ним по тому же участку, что и колхицин. Среди митостатиков, не конкурирующих с колхицином за связывание с тубулином, наиболее известны алкалоиды барвинка винбластин и винкристин. Эти вещества также связываются с тубулином нековалентно и не изменяясь химически . i . Vi . , i, i, i, . Образование паракристаллов тубулина может быть использовано и реально использовалось в прошлом для выделения тубулина из ряда объектов см. ii, Впрочем, поскольку высокие концентрации винбластина способны осаждать не ТОЛЬКО тубулин, НО И другие кислые белки i . М. Из концентрационной зависимости образования паракристаллов тубулина следует, что лишь при связывании винбластина с участком белка, имеющим низкое сродство к митостатику наблюдается его осавдение , , . Имеются указания на то, что осаждение тубулина винбластином приводит к освобождению из комплекса с белком прочно связанного ГТФ , ii, , не влияя на нуклеотид, связанный на Еучастке. Для осаждения тубулина винбластином необходимо, чтобы на участке белка находился ГТФ, а не ГДФ . , ii, .