Сравнительный анализ структурной организации кластера рибосомных генов ракообразных

• Автор: Загоскин, Максим Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Организация кластера рибосомных генов эукариот.

1.1. Структурные и функциональные особенности организации рДНК

1.2. Явление ядрышкового доминирования.

1.3. Избыточность числа копий рДНК в геноме эукариот.

1.4. Направленные изменения количества копий рибосомной ДНК в

геноме эукариот

1.5. Молекулярная эволюция рДНК и ее использование в

филогенетических исследованиях.

2. Краткая характеристика микросателлитных и межмикросателлитных I последовательностей.
3. Феномен диминуции хроматина.
3.1. Диминуция хроматина у нематод
3.2. Элиминация хромосом на примере двукрылых.
3.3. Диминуция хроматина при созревании вегетативных ядер
макронуклеусов у инфузорий.
3.4. Диминуции хроматина у пресноводных копепод i,
, .
3.5. Диминуция хроматина у i.
4. Состав элиминируемой ДНК и молекулярные механизмы диминуции хроматина
4.1. Молекулярная свалка в геноме Ми представителей отряда
i.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Сбор материала.
Выделение тотальной ДНК циклопов.
Полимеразная цепная реакция
Электрофорез.
Получение очищенных продуктов ПЦР
Лигирование фрагментов ДНК.
Трансформация клеток Е. со и селекция колоний
Приготовление компетентных клеток .i.
Трансформация компетентных клеток .i.
Выделение плазмидной ДНК методом быстрого лизиса для
идентификации истинных рекомбинантов.
Выделение плазмидной ДНК для секвенирования
Скрининг клонов со вставкой и определение размеров клонированного
фрагмента с помощью ПЦР
Секвенирование.
i
Измерение концентрации нуклеиновых кислот
Методы биоинформатического анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ эволюционной изменчивости рибосомной ДНК отряда i .
1.1. Исследование филогенетических взаимоотношений между
представителями отряда i на основе последовательностей гена рРНК
1.2. Исследование филогенетических взаимоотношений между представителями семейства i на основе внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК I1 и I2 .
1.3. Исследование изменчивости рДНК двух близкородственных видов циклопов рода С. iii и С. i
1.4. Характеристика степени эволюционной изменчивости внутренних транскрибируемых спейсеров I1, I2 и участка гена рРНК двух географически отдаленных популяций i.
2. Исследование изменений структуры кластера рДНК в процессе диминуции хроматина С. i.
2.1. Разработка маркера диминуции хроматина на основе межмикросателитных последовательностей I i i
2.1.1. Характеристика Iпослодовательностей геномной ДНК бластомеров С. i до диминуции хроматина.
2.1.2. Характеристика описанных Iфрагментов в геноме соматических клеток С. i.
2.2. Определение уровня внутригеномной изменчивости рДНК С. i посредством сравнения последовательностей нуклеотидов рДНК соматических клеток и бластомеров до диминуции хроматина
2.3. Определение числа копий рДНК в геноме соматических клеток и бластомеров до диминуции хроматина С. i.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В процессинге прерРНК принимают участие малые ядрышковые РНК мякРНК 3, 8, и ряд регуляторных белков Жарская, Зацепина, . Во время процессинга прерРНК происходит около последовательных эндо и. У разных видов очередность разрывов и промежуточные интермедианты могут отличаться , . Хотя, спейсерные участки рДНК различных организмов варьируют по протяженностии нуклеотидному составу, именно они отвечают за точность, эффективность и порядок процессинга. В процессинге рРНК немаловажную роль играет вторичная структура прерРНК, в особенности, образующиеся шпилечные структуры. Показано, что протяженные центральные шпильки, образующиеся во вторичной структуре спейсеров прерРНК, обуславливают связывание трансдействующих факторов облегчающих узнавание сайта разрезанияпрерРНК , . В результате процессинга образуются РНК предшественники рибосомных. Как. РНК и рибосомальными белками, и большой субъединицы , состоящей по крайней мере, из трех отдельных рРНК 5, 5. Следует отметить, что 5 ген рРНК расположен в отдельном кластере, у большинства видов он локализован вне ядрышка, и транскрибируется РНКполимеразойIII . Рибосомные гены имеют, особенную организацию в геноме не только на молекулярном4 уровне, но и на уровне клеточного ядра. Кластеры, тандемно повторенных рибосомных генов рДНК в интерфазном ядре у высших эукариот формируют особый структурный домен ядрышко Жарская, Зацепина, . В ядрышке, особенно в его гранулярной зоне, содержится большое количество белков. По данным массспектрометрии ядрышки, полученные из клеток человека , содержат порядка 0 различных белков . Транскрипты прерРНК образуются, главным образом, на границе фибриллярного центра i . ДНК, и плотного фибриллярного компонента, в котором происходят основные этапы созревания транскриптов прерРНК ii . В гранулярной зоне, занимающей основной объем ядрышка в пролиферирующих клетках, происходит заключительная стадия созревания рибосомных частиц и их сборка , . Рисунок 1. Схема строения кластера рибосомной ДНК эукариот. Структура повторов рДНК , 5. РНК I1 и I2 внутренние транскрибируемые спейсеры или I нетранскрибируемый спейсер или межгенный спейсер, включающий последовательности внешних транскрибируемых спейсеров на рисунке не показаны и промоторную область. Растущим и делящимся клеткам требуется большое количество рибосом, поэтому транскрипция идет одновременно с нескольких транскрипционных единиц прерРНК. Однако не все копии преРНК имеют одинаковое функциональное состояние. РНКполимеразой I, остальные копии прерРНК в ходе всего клеточного цикла остаются не связанными с транскрипционным комплексом i, , . Даже в клетках с высокой потребностью в синтезе рРНК на протяжении всего клеточного цикла присутствует фракция молчащих рРНК генов , . Сформировалось представление о том, что весь хроматин рибосомных генов эукариот представлен в трех состояниях в неактивном плотноупакованном с участием нуклеосом состоянии, соответствующем гетерохроматину, в деконденсированном активно транскрибирующемся состоянии, и в состоянии, когда рДНК расплетена, связана транскрипционным комплексом, но не транскрибируется. В последних двух случаях рДНК имеет эухроматиновую структуру . Первое указание на отсутствие прямой связи между эухроматиновым состоянием рибосомных генов и активной транскрипции прерРНК было получено при исследовании фотоактивируемого связывания псораленом рибосомного хроматина. Псорален фурокумарин, содержащийся в плодах и корнях растения псорален костянковой . Под действием света псорален может связываться с ДНК, находящейся в декомпактизованной, лишенной нуклеосом форме, при этом в агарозном геле связанная таким образом ДНК мигрирует отлично от упакованной в нуклеосомы и не связанной с псораленом ДНК i . Таким образом, было обнаружено два состояния рибосомного хроматина активный эухроматин, связывающийся псораленом и молчащий гетерохроматин, не взаимодействующий с псораленом. При этом было замечено, что соотношение этих двух форм хроматина не изменяется на протяжении всего клеточного цикла, несмотря на изменяющуюся активность генов рДНК.