Ген гемолизина II Bacillus cereus: клонирование, регуляция экспрессии, идентификация продукта

• Автор: Бударина, Жанна Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гемолизины как группа бактериальных токсинов

1.1.1.Общие сведения о бактериальных токсинах

1.1.2. Место гемолизинов в классификации токсинов

1.1.3. Гемолизины как факторы патогенности и вирулентности

1.1.4. Эволюционная и адаптационная роль гемолизинов

1.2. Типы бактериальных гемолизинов

1.2.1. Фосфолипазы цитолизины с ферментативной активностью

1.2.2. Порообразующие гемолизины

1.2.2.1. Гемолизин Е. i и семейство X

I.2.2.2. Гемолизины семейства i
1.2.2.З. РСкладчатые каналобразующие цитолизины.
Семейство токсинов
I.2.2.4. рСкладчатыс каналобразующие цитолизины
аэролизинового тина аГемолизин .
1.3. Регуляция экспрессии генов бактериальных гемолизинов
1.3.1. Общие принципы регуляции
1.3.2. Системы, контролирующие гены гемолизинов у
1.3.3. Генетические механизмы, контролирующие экспрессию гемолизинов
у ii
1.3.4. Регуляция экспрессии гемолизинов у ii i
1.4. Гемолизины i
1.4.1. В. как объект для изучения гемолизинов
1.4.2. Спектр гемолизинов, продуцируемых i
1.4.2.1. Сфиигомислиназа и цереолизин АВ
I.4.2.2. Цереолизин гемолизин I
1.4.2.З. Гемолизин
1.4.2.4. Гемолизин III
I.4.2.5. Гемолизин IV токсин
1.4.2.6. Цсрсолизинподобный гемолизин
1.4.2.7. Гемолизин II
1.4.3. Регуляция продукции гемолизинов у В.
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
.1. Материалы
II. 1.1. Штаммы бактерий, фаговые и илазмидныс векторы
II. 1.2. Среды и основные буферы
II. 1.3. Материалы и реактивы
.2. Методы исследования
.2.1. Выделение тотальной ДНК из микроорганизмов рода i
.2.2. Выделение илазмидной ДНК
.2.3. Выделение одноцепочечной ДНК фага М
.2.4. Препаративное выделение фрагмента ДНК
.2.5. Получение компетентных клеток .i и их трансформация
.2.6. Получение компетентных клеток В. ii и их трансформация
И.2.7. Отбор рекомбинантных клонов по гемолитическому фенотипу
.2.8. Тестирование клонов на наличие активности фосфолипазы С
.2.9. Анализ рекомбинантных клонов
.2 Проведение реакций модификации ДНК
.2 ПЦРамплификация ДНК
.2 Плазмидные конструкции
.2 Определение и анализ первичной последовательности ДНК
.2 Д1 IДНК гибридизация
.2 Получение миниклеток и анализ их белков, кодируемых плазмидами
.2 Получение бесклеточных экстрактов
.2 Тестирование гемолитической активности
.2 Тестирование влияния холестерина
.2 Фракционирование клеток
.2 Определение Ргалактозидазной активности
.2 Экспрессия и очистка до гомогенного состояния рекомбинантного
белка 6iII.
.2 Электрофорез в ПААГ
.2 Тестирование связывания 6iII с ДI
.2 Футпринтинг
.2 Реакция удлинения праймера
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1.Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II
1.1.1.Получение рекомбинантных гемолитических клонов и их
фенотипический анализ
III. 1.2.Физнчсскос и делециоиное картирование рекомбинантных плазмид
III. 1.3. Идентификация гемолизина, кодируемого клонированным фрагментом ДНК
1.1.3.1. Способы идентификации
III. 1.3.2. Гибридизационный анализ
III. 1.3.3. Идентификация с использованием функциональных и
биохимических тестов
III. 1.3.4 Гемолизин II и цсрсолизинподобный гемолизин
1.2. Некоторые свойства гемолизина II, продуцируемого рекомбинантными клетками . i и В. ii
1.2.1. Оценка молекулярной массы гемолизина II
1.2.2. Действие гемолизина II на эритроциты различных видов млекопитающих
Ш.2.3. Продукция гемолизина II рекомбинантными клетками . i и
В. ii локализация, влияние температуры
III.2.4. Температурная инактивация гемолизина II
1.3. Анализ нуклеотидной последовательности гена гемолизина II В. и выведенной аминокислотной последовательности
1.3.1. Локализация гена гемолизина II в пределах клонированного
фрагмента ДНК
1.3.2. Анализ первичной структуры гена II
1.3.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности
гемолизина II
1.3.3.1. Общий заряд белка
Ш.3.3.2. Анализ предполагаемого сигнального пептида
П.З.З.З. Гомология гемолизина II с атоксином . и
с другими белками
1II.3.3.4. Участие Сконцсвой области гемолизина II в обеспечении его
гемолитической функции
1.4. Распространение гемолизина II среди представителей i
цереусной группы
1.4.1. Тестирование штаммов на присутствие последовательностей ДНК, гомологичных участку, содержащему
1.4.2. Тестирование гемолитической активности штаммов
III.4.3. Клонирование и идентификация генетической детерминанты
гемолизина II В. iii
1.5. Регулятор экспрессии гена гемолизина II В.
1.5.1. Анализ нуклеотидной последовательности области ДНК,
прилежащей к Зконцу гена обнаружение
1.5.2. Влияние гена на гемолитическую активность,
обусловленную экспрессией
1.5.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности
1.5.4. Влияние на экспрессию галактозидазы, осуществляемую с промоторной области
1.5.5. Выделение рекомбинантного белка 6iII
1.5.6. Выявление операторного участка для II
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Провести скрининг коллекции штаммов бацилл цереусной группы на наличие последовательностей ДНК, гомологичных области, содержащей ген гемолизина II, и на продукцию подобного гемолизина. Определить роль нового гена I в регуляции экспрессии и характер особенности этой регуляции. Данная работа выполнена в лаборатории генной систематики и ВНТК генной активности Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН. Научная новизна работы. Результаты, полученные в ходе данных исследований, носят приоритетный характер. Впервые клонирован ген гемолизина II i . Тем самым положен конец многолетней дискуссии о существовании этого гемолизина и доказано, что он является самостоятельным белком В. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена гемолизина II и получены данные, позволяющие причислить этот белок к группе рскладчатых олигомерных норообразуюгцих цитолизинов. Впервые показано, что способность В. И является штаммоспецифичным свойством но причине ограниченного распросгранения его гена среди штаммов этого вида. Впервые установлено, что многие штаммы В. II В. Впервые клонирован ген этого гемолизина В. Обнаружен и клонирован новый регуляторный ген В. II. Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание феномена гемолитического фенотипа и молекулярных основ вирулентности В. Эти данные являются необходимым первоначальным этапом, закладывающим основу для дальнейших исследований гемолизина II выяснения его участия в патогенезе, изучения его структурнофункциональных особенностей, что позволит в перспективе использовать этот объект при исследовании клеточной физиологии и функционирования мембран клеток. Тот факт, что гемолизин II обнаружен у В. Обнаружение нового регуляторного локуса В. II, является шагом к выяснению сложных механизмов скоординированной регуляции генов, обеспечивающих вирулентность этого микроорганизма, что в перспективе позволит осуществлять контроль над его патогенными свойствами. Глава I. Определение. Согласно классическому общему определению, бактериальные токсины это группа бактериальных продуктов, принципиальным свойством которых является способность повреждать или убивать живые объекты при воздействии в относительно малых количествах i, . Более точное определение затруднительно вследствие разнообразия структуры, механизмов действия, иммуногенности и других свойств известных на сегодняшний день бактериальных токсинов. Как правило, токсины представляют собой относительно высокомолекулярные субстанции в форме белков, пептидов или полисахаридов. Однако известны и некоторые бактериальные токсины с молекулярной массой менее 0 Да. Роль в патогенезе. Одним из наиболее важных вопросов при изучении токсинов является вопрос об их роли в патогенезе. В тех случаях, когда болезнь является непосредственным следствием интоксикации, как, например, при пищевых отравлениях, на данный вопрос ответить наиболее легко. В подобных ситуациях нередко живые бактериальные клетки отсутствуют ко времени воздействия токсического вещества, и экспериментальное воспроизведение болезни может быть вызвано непосредственно воздействием токсина. Несколько труднее выяснить роль токсина в патогенезе, когда продукция этого вещества осуществляется бактериями, размножающимися в хозяине. В этих случаях нужен ряд условий для успешной продукции токсина. К таким условиям относятся дополнительные факторы, вырабатываемые микробом, которые необходимы для его проникновения и поддержания в хозяйском организме. Гораздо сложнее приписать конкретному токсину определенную роль в патогенезе, когда при размножении в организмехозяинс бактерия производит более одного токсина. Тем не менее, определенно можно утверждать, что вес болезни, вызываемые бактериями, прямо или косвенно обусловлены действием токсинов . Па настоящий момент не существует единой классификации токсинов. И, хотя подробное рассмотрение этого вопроса выходит за рамки данной работы, представляется уместным указать самые общераспространенные подходы к классификации токсинов. Бактериальные белковые токсины можно разделить на два основных класса цитотоксические и цитолитические токсины Vi , .