Изменения комплекса рибосомных генов человека в процессе естественного и репликативного старения

• Автор: Малиновская, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Молекулярные механизмы старения

1.1 Роль соматических мутаций

1.2 Митохондриальная теория старения и роль окислительного стресса

1.3 Накопление измененных белков.

1.4. Нарушения метаболизма сахаров.

1.5 Метилирование ДНК и старение.

1.6 Репарация ДНК и старение.

1.7 Утрата теломер и старение

1.8 Апоптоз и продолжительность жизни

2. Изменение основных характеристик рибосомных генов млекопитающих при старении
2.1 Структурнофункциональная организация рибосомных генов.
2.2 Основные характеристики комплекса рибосомных генов и их варьирование в различных возрастных группах млекопитающих.
2.2.1 Число копий рибосомных повторов в геноме человека
2.2.2 Изменение числа копий рДНК при старении
2.3 Активные копии рибосомных генов в геноме человека
2.3.1 Селективная окраска ядрышкообразующих районов метафазиых хромосом
2.3.2 Изменение активности рибосомных генов при старении.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Анализируемая выборка
2. Выделение ДНК из периферической крови, клеточной массы и среды
культивирования фибробластов
3. Определение концентрации ДИК.
4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома
человека в яДНК и в вкДНК
5. Определение относительного количества активных РГ АкРГ
6. Исследование репликативного старения и действия хромата калия на культивируемые фибробласты.
7. Количественная опенка гена рРНК методом i ПЦР.
9. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Е Свойства комплекса РГ людей среднего и старшего возраста.
1.1 Число копий РГ в геноме.
.2 Анализ содержания трех контрольных повторяющихся
последовательностей генома человека в группе СВ и ГС.
1.2.1 Теломерный повтор
1.2.2 Гистоновые гены
1.2.3 Сателлит 3 1
1.3 Относительные количества активных копий РГ
1.4 Изменение количества метилированных копий РГ при старении.
2. Влияние свойств комплекса РГ на репликативное старение
2.1 Основные характеристики штаммов фибробластов кожи человека
2.1.1 Свойства комплекса РГ
2.1.2 Маркеры репликативного старения
2.1.3 Сопоставление свойств комплекса РГ и маркеров старения
3. Изменения свойств комплекса РГ при репликативном старении.
3.1 Изменение содержания контрольных повторов ТГ1 и СатШ
3.2 Изменение содержания РП и уровня метилирования РП.
3.3 Повреждение ДНК рибосомных генов при репликативном старении
4. Влияние свойств комплекса РГ на функционирование культивируемых фибробластов кожи в условиях окислительного стресса, вызываемого хроматом калия
4.1 Ранний ответ фибробластов на действие малых доз К2СЮ4
4.1.1 Изменение количества клеточной РНК
4.1.2 Изменение активности ядрышка
4.1.3 Изменения уровня апоптоза.
4.2 Поздний ответ фибробластов на действие хромата калия
5. Влияние количества АкРГ в геноме на нуклеазную активность клеток
5.1 Уровень нуклеазной активности в штаммах фибробластов при стандартных условиях культивирования.
5.2 Изменения НА клеток при действии малых доз хромата калия
5.3 Изменение НА в процессе апоптоза клеток поздний ответ на действие К2СЮ4.
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Список литературы.
СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ЛК аминокислота
АкРГ активные копии рибосомных генов
АпоЕ аполипоиротеип Е
АФК активные формы кислорода
АХ акроцептрическая хромосома вкДНК внеклеточная ДНК
ГС группа сравнения
ДМФА диметилформамид
Д1Т дигиотрейтол
ЗД здоровые доноры
КМРГ кластеры молчащих т.с. неактивных генов
ЛВП линопротеины высокой плотности
ЛНИ липонреины низкой плотности
МЧП максимальное число пассажей
НА нуклсазная активность
НК нуклеиновая кислота
Г1Г1АГ полиакриламидный гель
ПНР полимеразная цепная реакция
РА ревматоидный артрит
РГ рибосо.млые гены
РП рибосомный повтор
СатШ субфрагмент сателлита III человека
СВ люди старческого возраста
СОД суисроксиддисмутаза
ТО транскрибируемая область
ТОрДНК транскрибируемая область рибосомного повтора
ТП теломерный повтор
ФГА фитогемагглютинин
ЭДТА зтилендиаминтетрауксусная кислота
ЭЦР экстрахромосомная циклическая рРНК яДНК ядерная ДНК
ЯОР ядрышкообразующие районы хромосом
3 внешний транскрибируемый спейсер основания
5 внешний транскрибируемый снейсер основания
i ЯОР хромосом, окрашивающиеся нитратом серебра
v i продукты гликозилированные продукты
В биотин
I 5бром4хлор3индолил фосфат
суперсемейство нитохромов
глицеральдегид фосфодигедрогеназа
суперсемейство i лутатионi рансфераз
I1 внутренний транскрибируемый спейсер
I2 внутренний транскрибируемый спейсер митохондриальная ДНК
Му8 миелондный фактор дифферснпировки
нитрогетразолий голубой
I нетранскрибируемый межгснный спейсер основания стрессассоциированное старение клеток
додецилсульфат натрия
стандартный солевой раствор
тетраметилэтилендиамин
i рецепторы.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Рибосомные гены РГ, кодирующие рибосомные РНК , I, 5. РНК, имеют принципиальное значение для функционирования эукариотической клетки. Для обеспечения синтеза большого количества молекул рРНК, необходимых для функционирования клеток организма, в геноме человека содержится от 0 до 0 копий РГ . Вейко и соавтр. В соматической клетке человека транскрибируется только копий РГ от общего количества Вейко , , которые называют активными копиями РГ АкРГ. Помимо этого, к варьирующим признакам генома можно отнести количество метилированных копий РГ. В литературе уже давно дискутируется вопрос о возможной связи характеристик комплекса РГ генома млекопитающих и старения. Однако опубликованные данные противоречивы. В нескольких работах сообщалось об уменьшение числа копий РГ при старении тканей миокарда . В ряде работ было обнаружено, что при старении клеток сердца, селезенки, печени и мозга мышей Опо Т. РГ в геноме. Столь же противоречивые данные получены при исследовании изменения метилирования РГ при старении. Сообщалось об увеличении метилирования при старении культивируемых фибробластов кожи человека . С.С. Вейко и соавтр. По данным других авторов, при старении млекопитающих уровень метилирования РГ не изменяется или снижается v . V. . Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась 1 в оценке возможного влияния свойств комплекса РГ человека на продолжительность жизни и 2 в анализе изменения свойств комплекса РГ при старении организма естественное старение и культивируемых клеток человека репликативное старение. РГ культивируемых фибробластов на устойчивость клеток к апоптозу, индуцируемому окислительным стрессом. Научная новизна. Впервые показано, что количество АкРГ у людей, достигших летнего возраста, варьирует в пределах достаточно узкой адаптивной нормы. Впервые найдено объяснение противоречивым результатам относительно снижения числа копий и изменения уровня мегилирования РГ при старении обнаружено, что при старении происходит потеря высокометилированных кластеров неактивных РГ, если таковые присутствовали в геноме. Впервые показано, что свойства комплекса РГ не влияют на нормальное репликативное старение культивируемых фибробластов, но влияют на устойчивость клеток к апоптозу, который индуцируется дополнительным окислительным стрессом. АкРГ характеризуются значительно более высоким уровнем эндонуклеазной активности. Научнопрактическая значимость работы. Данные о распределении количества АкРГ в геномах старых людей могут помочь при составлении прогнозов длительности жизни и риска развития патологии, индуцируемой окислительным стрессом, у различных групп населения. Данные о влиянии количества АкРГ в геноме клетки на изменения уровня апоптоза при действии повреждающих факторов внешней среды могут оказаться полезными при разработке схем клеточной терапии. Описана схема анализа ряда маркеров, которые позволяют прогнозировать различия в длительности пролиферативного периода и в уровне спонтанного апоптоза нескольких культур клеток уже на ранних пассажах, что также может иметь значение для клеточных технологий . Положения, выносимые на защиту. В выборке людей старческого возраста по сравнению с людьми среднего возраста значительно сужены интервалы варьирования общего числа копий РГ в геноме и количества активных копий РГ. Комплекс РГ старых людей практически не содержит высокометилированных кластеров молчащих рибосомных копий. При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека геном теряет высокометилированные кластеры копий РГ. При репликативном старении происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении данных i ПЦР. Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения содержание теломерного повтора и уровень спонтанного апоптоза не зависят от свойств комплекса РГ и от возраста доноров кожи. При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме.