Изучение трансгенных растений с гетерологичным геном, детерминирующим синтез двунитевой РНК

• Автор: Коростылева, Татьяна Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Оглавление.

Список сокращений.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Подходы к изучению и созданию устойчивости.

Искусственно детерминированная устойчивость растений к вирусам

1.1.1. Устойчивость, обусловленная встраиванием генов вирусного происхождения iv i.

1.1.1.1 Устойчивость, детерминированная встраиванием гена

белка оболочки вируса

1.1.1.2. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием гена

репликазы
1.1.1.3. Устойчивость, определяемая встраиванием гена
транспортного белка
1.1.1.4. Введение в геном растений вирусных нуклеотидных
последовательностей
1.1.1.5. Проблемы, связанные с использованием
трансгенов, и перспективные направления защиты растений
1.1.2. Устойчивость, основанная на использовании механизмов
замолкания
1.1.3. Создание устойчивости с использованием генов
растений
1.1.4. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием
гетерологичных, экзотических генов
1.1.4.1. Введение генов белков, инактивирующих рибосомы
1.1.4.2. Введение генов нуклеаз.
1.1.4.3. Использование генов иммунной системы животных.
1.1.4.3.а. Введение генов интерферонов
1.1.4.3.Ь Введение компонентов 25А системы
1.1.4.3.С. Введение.генов, кодирущие антитела
1. 2. Двунитевая РНК в организме животных и растений
1.2.1. Важнейшие свойства
1.2.2. Общий механизм
1.2.3. РНКзависимое метилирование ДНК и
транскрипционное умолкание генов
1.2.4. Микро РНК i растений.
1.2.4.1. Происхождениеи структура i.
Механизм действия и функции микроРНК.
Генетический контроль процессов РТСБ РНКинтерференции и связанного с ними метилирования у
растений
Проблемы неспецифичности действия дцРНК.
Материалы и методы
Штаммы бактерий.
Плазмиды
Растения
Штаммы вируса табачной мозаики
Ростовые среды
Получение бинарного агробактериального вектора
Получение трансгенных растений
Трансформация табака
Процедура трансформации пшеницы.
Отбор трансгенных растений табак, устойчивых к канамицину
Тестирование на устойчивость к канамицину потомства трансформантов пшеницы
Молекулярнобиохимические
исследования
Выделение ДНК и РНК из растительных
ПЦР.
Саузерн и Нозерн гибридизация.
Исследование растений на вирусоустойчивость.
Процедура заражения.
Оценка устойчивости.
Экстракция белков листьев.
Электрофорез растворимых белков листьев.
Анализ белков.
Гидролиз белка
ВЭЖХ триптических пептидов
Секвенирование пептидов.
Статистическая обработка и компьютерный анализ
Результаты и обсуждение.
Трансформация растений табака и исследование трансгенных растений табака.
3.1.1. Характеристика ТДНК экспрессионноговектора
3.1.2. Получение трансгенных растений табака
3.1.3. Наследование трансгеыной вставки.
3.2. Исследование вирусоустойчивости трансгенных растений
табака
3.2.1. Изучение фитопатологических характеристик
трансгенных растений.
3.2.2. Изучение спектра растворимых белков
3.3. Исследование морфофизиологических характеристик
трансформантов табака
3.4. Трансформация пшеницы
3.4.1. Выделение трансформантов пшеницы.
3.4.2. Наследование трансгенной вставки.
3.4.3. Анализ на отсутствие агробактерий
3.4.4. Тестирование на устойчивость к канамицину
3.4.5. Эффективность трансформации пшеницы
3.4.6. Изменения признаков у трансформантов пшеницы Т2
3.4.7. Наследуемость изменения признаков
Заключение
Выводы
Список литературы


Создание трансгенных растений, экспрессирующих антисмысловые последовательности вируса и обладающих устойчивостью к нему как предполагалось, за счет образования дуплекса II с геномной РНК вируса положило начало отдельной антисмысловой стратегии создания устойчивости I, i, . , . В г. В серии работ Гамильтон и Болкомб раскрыли механизм IIинтерференции i . , . ., , показав ключевую роль рестрикции двунитевой РНК в ингибировании экспрессии генов, обладающих гомологией с последовательностью такой же РНК. Поэтому представлялось интересным исследовать влияние эндогенно синтезируемой в растении протяженной двунитевой РНК, не имеющей гомологии с геномом растения и геномом вируса, на устойчивость растений к вирусам. В качестве трансгенной кодирующей последовательности, экспрессирующей днРНК, для предотвращения эффекта умолкания генов растения был использован фрагмент бактериального гена. Целью работы явилось изучение влияния гетерологичной конструкции, обеспечивающей в растении синтез двунитевой РНК, не несущей гомологии с геномами вирусов и растений, на устойчивость трансгеиных растений к вирусным заболеваниям, а также исследование влияния этой гетерологичной вставки на морфофизиологические признаки однодольных и двудольных растений МсоНат и ТгШсит аеБит. Глава 1. Обзор литературы. Подходы к изучению и созданию устойчивости у растений. Искусственно детерминированная устойчивость растений к вирусам. Вирусы растений очень разнообразны по своей структуре, способам репликации и передачи, а также по патогенным эффектам на организм. Поэтому неудивительно, что в процессе эволюции в растениях возникли множество разнообразных сигнальных систем, узнающих различные патогены, и механизмов устойчивости, многообразие которых рассматривается в ряде обзоров и монографий Ладыгина, Бабоша. Тарчевский, Тарчевский, . Сведения, полученные при изучении устойчивости на разных уровнях, выявление с их помощью ключевых моментов в развитии инфекционного процесса и формировании устойчивости, помогает исследователям определять пути для создания растений, устойчивых к вирусному поражению. Увеличивающийся объем знаний в области молекулярной генетики растительных вирусов, полученные за последние двадцать лет данные о естественных системах защиты растений привели к разработке и развитию большого числа новых стратегий генетического контроля над вирусными заболеваниями растений. Эти подходы различаются степенью эффективности и универсальности, и число их постоянно растет. Их сравнительный анализ можно найти в ряде обзоров . . i М. Наиболее удачная классификация подходов, предложенных для повышения устойчивости растений, приведена в обзоре Гольдбаха . Л определенной ориентации. РНК. Вирусы растений имеют небольшие геномы и содержат ограниченное число генов, функции которых довольно хорошо изучены. Так как вирусы нуждаются в репликации генома, его инкапсидации, распространении из места инфицирования по всему организму и далее через переносчики в окружающую среду, в состав вирусного генома входят специфические гены для осуществления этих процессов. Эти гены являются подходящими потенциальными источниками для применения защиты, основанной на концепции . Идея такой защиты была впервые сформулирована в работе Сэнфорда и Джонсона в г. . . Эта устойчивость обусловлена искусственно вызываемыми изменениями в метаболизме вирусов. Необходимое условие при использовании вирусного гена для трансформации растений отсутствие у продукта данного гена способности влиять на жизненно важные функции растенияхозяина. В настоящее время имеется несколько успешно применяемых стратегий получения устойчивых трансгенных растений с использованием генов вирусного происхождения. Введение в геном растений генов, экспрессирующих вирусные белки в том числе и дефектные, которые способны функционально интерферировать с белками вируса в случае заражения им трансгенных растений. К таким генам относятся гены белка оболочки, гены репликазы, гены транспортного белка. Введение вирусных нуклеотидных последовательностей как целого генома, так и его части i, в виде фрагмента субгеномной РНК.