Внутривидовой полиморфизм и особенности экспрессии генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы (Apis mellifera L. )

• Автор: Львов, Алексей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 153 с.

1.1. Представление об иммунитете насекомых.

1.2. Антибактериальные пептиды насекомых.

1.2.1. Многообразие антибактериальных пептидов насекомых.

1.2.2. Особенности экспрессии генов антибактериальных пептидов.

1.2.3. Механизм действия антибактериальных пептидов

1.3. Иммунитет и система антибактериальных пептидов медоносной пчелы

1.3.1. Иммунитет медоносной пчелы

1.3.2. Антибакгериальные пептиды медоносной пчелы

.Л .
ф

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1. Характеристика объектов исследования
2.2. Описание исследованных регионов.
2.3. Методы исследования антибактериальных пептидов медоносной пчелы
2.3.1. Консервация пчел для перевозки и храпения.
2.3.2. Выделение ДНК и РНК.
2.3.3. Амплификация тотальной ДНК
2.3.4. Электрофоретическое фракционирование ДНК
2.3.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.3.6. Перенос РНК на мембранные фильтры.
2.3.7. Радиоактивное мечение препаратов ДНК
2.3.8. Молекулярная гибридизация.
2.3.9. Элюция ДНК из агарозных гелей.
2.3 Клонирование фрагментов генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы.
2.3 Подготовка компетентных клеток . i.
2.3 Трансформация компетентных клеток i плазмцдной ДНК.
2.3 Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК.
2.3 Секвснированис ДНК ферментативным методом
2.3 Электрофоретическое фракционирование ДК в денатурирующих условиях ссквснируюший ельэлектрофорез.
2.3 Составы использованных стандартных растворов.
2.4. .Методы идентификации расового происхождения
2.4.1. Морфомстричсский анализ.
2.4.2. Анализ полиморфизма мтДНК локус II
2.5. Компьютерный анализ и статистическая обработка результатов
Глава 3. Амплификация и поиск полиморфизма участков генов
антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина и дефензина
медоносной пчелы i i
3.1. Анализ известных нуклеотидных последовательностей и подбор
праймеров
3.2 Определение нуклеотидной последовательности и идентификация полученных ПЦРамплнфицированных фрагментов.
3.3 Полиморфизм генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы. Глава 4. Экспрессия генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина,
дефензнна у медоносной пчелы i i.
4.1 Экспрессия генов антибактсриатытых пептидов i i абеципа, гименоптецина, дефензина в ходе инфекционного процесса и при
действии адаптогена оксперимегг
4.2. Межрасовые различия характера экспрессии генов антибактериальных пептидов абеципа, гимсноптецииа, дефензина у пчел i i
i и i i i эксперимент II
Глава 5. Полиморфизм гена дефензина в башкирской популяции медоносной пчелы i i.
5.1. Гетерогенность субпопуляций медоносной пчелы по полиморфному
локусу гена дефеизнна
5.2. Итггегральная гетерогенность субпопуляций РБ
Список литературы
Список сокращений
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
мтДНК митохондриальная ДНК
я ДНК ядерная ДНК
кДНК комплементарная ДК
РНК рибонуклеиновая кислота
мРНК матричная РНК
рРНК рибосомная РНК
1ЦР папимеразная цепная реакция
ДРФ полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
ПДАФ полиморфизм длины амп.тифнцированных фрагментов
АБП антибактериальные пептиды
ВТБ битоксибациллин
ХОС хитоолигосахариды
РБ Республика Башкортостан
ii i
ii i
Введение


Сердечно благодарю за оказанную помощь в сборе материала и кршческнс замечания всех сотрудников лаборатории биохимии адаптивности насекомых ИБГ УНЦ РАН. Глава 1. Насекомые одна из наиболее многочисленных и широко распространенных трупа животного мира. Успех в обширном расселении насекомых частично объясняется их способностью воспроизводить свой рол в огромном количестве копий. Вторая важная причина такой жизнеспособности заключена в их защитных механизмах или иммунной системе Купер, . По вопросам о способах противодействия организма насекомых инфекционным и инвазионным агентам чужеродной природы принято считать, что оно происходит как при помощи клеточного фагоцитарного иммунитета, так и путм гуморального биохимическою иммунитета, при котором вступает в действие ряд антибиотических факторов различной природы Кузнецов, . Клеточный иммунитет насекомых опосредован гемоцитами, а также органами кровотворсния и представлен такими процессами как фагоцитоз и инкапсуляция. Гуморальный иммунитет имеет внеклеточную природу и опосредуется различными биохимическими факторами гемолимфы, обеспечивая такие процессы, как агглютинация, коагуляция, опсонизация. Исторически сложившаяся полярность относительно вопроса иммунитета, представленная фагоцитарной теорией с одной стороны, и моральной, с другой, на сегодняшний день утратила свою актуальность. В результате новых исследований в области внеклеточного иммунитета насекомых были выявлены н охарактеризованы такие факторы как шггибактериальные пептиды, лектниы, фенолоксидазный каскад. В защите насекомого против болезнетворных организмов важную роль играют различные типы клеток гемолимфы. Небольшие инородные агенты, такие как бактерии или грибы, подвергаются фагоцитозу, а более крупные агрегаты инородных клеток или паразитические организмы, например нематоды, подвергаются инкапсуляции. В результате обширного заражения инородными клетками формируются узелки кламны. Последний процесс подобен коагуляции и начинается вокруг сгустка иммобилизованных инородных тел Вотан. НиИтагк. Различают две формы инкапсуляции 1 образование гранул с небольшими частицами бактерии и т. В обоих случаях образуется многослойная капсула, состоящая из 3х слобв 1 внутренний, состоящий из разрушенных и мел авизированных клеток 2 средний, образованный уплощнными клетками 3 наружный из нормальных гемоцкгов, недавно прикрепившихся к поверхности капсулы. Формирование капсулы происходи в две физиологические фазы. Первая фаза прикрепление гемоцкгов к поверхности инородного тела и выделение ими коагулогена, лнзоци. Вторая фаза заключается в объединении гемоцигов в гладкую капсулу, прикрепившуюся к тканям хозяина Глупов, . Кузнецову, i, Ii, Тышенко, i, . Следует заметить, что отсутствие единой номенклатуры гемоцитов привело к выделению, по меньшей мере, шести типов гемоцитов насекомых, способных к фагоцитозу, которые, по всей видимости, можно отнести либо к плазмоцитам, либо к гранулоцгтам. Плазмощгты принимают участие в инкапсуляции и коагуляции. Однако основная часть кламиов образована продуктами гранулоцитов Вошап, , . Нарушение покровов и антигенное стимулирование приводит к морфологическому и количественному изменению клеток гемолимфы насекомого Запольских, Орехов, Моисеенко, ii, , Бартникайтс, Крнщунене, Глупов, . Характер изменения гемоцитарной картины организма вследствие инфицирования зависит от вида насекомого, вирулентности и титра инъецированных микроорганизмов . Как правило, сначала уменьшается число гемоцитов в основном плазматоцнюв и ранулошггов, которое через определенное время либо восстанавливается и затем возрастает, либо продолжает снижаться вплоть до смерти насекомого, не способного справиться с инфекционным заражением Баршикайте, Крищунснс. Глупов, . Первоначальное снижение числа клеток гемолимфы, видимо, связано с образованием клампов, состоящих из гемоцитов и бактерий, прикрепляющихся к внутренним поверхностям насекомых. При инъекции летальных доз микроорганизмов возможно нарушение гемопоэза, в результате чего общее количество гемоцитов уменьшается необратимо.