Бактериальные lux-опероны : Механизмы регуляции экспрессии и конструирование биосенсоров

• Автор: Манухов, Илья Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 85 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ стр.

1. Постановка задачи

2. Литературный обзор.

Экспериментальная часть.

3. Материалы и методы

4. Результаты и обсуждение.

1 Клонирование генов шАВ из хромосомы морских бактерий Vii

vi

2 Клонирование оиерона наземных бактерий i

штамм и определение нуклеотидной последовательности

3 Роль лротеазы в негативном контроле экспрессии генов I

ii ii в клетках ii i.
4 Использование ндонероиа ii ii для анализа активности мутантных форм протеазы и влияния молекул РНК, комплементарных
5 фрагменту мРНК гена , на синтез фермента .
А Мутантные формы протеазы ii i
Б РНК интерференция
5 Конструирование нхбиоссисора для количественной оценки
рекомбинационной активности бактериальных клеток.
6 Фолдннг и рефолдинг гермоинактивированных бактериальных люиифераз роль шаперонов и влияние термостабильиости
белка па эффективность рефолдинга
7. Выводы
8 Литература.
Постановка задачи
Актуальность


Высокая чувствительность, простота детектирования светового сигнала с помощью люминометра или сцинтиляциопного счетчика, прямая пропорциональность между количеством фермента люциферазы и интенсивностью биолюминесценции в пределах десяти порядков величины сигнала, возможность проведения измерений как i vi, так и i viv без разрушения клеток и ряд других преимуществ определяют применение генов люцифераз в различных генетических и биохимических тестах как, например, при поиске индуцируемых промоторов, при скрининге ДНК тройных соединений, при измерении микроколичеств АТФ и других. Бактериальные люциферазы являются гетеродимерами состоят из а и природный субстрат тетрадекан ал ь кислородом воздуха при участии восстановленного флавинмононуклеотида i . Реакция сопровождается высвечиванием кванта синезеленого света 0 нм. Ранее в нашей лаборатории были клонированы гены x i фанее Vii ii Чернова Т. Д. и Завильгельский Г. Б. . Однако, в связи с высокой термолабильностью люциферазы этого вида морских бактерий гены x А В НИ. Известно, что люцифераза Vii vi более термостабильна по сравнению с таковой . i . i Б. А. . Поэтому в настоящей работе были клонировали гены их А В V. Также с цслыо получения более гермостабильной люциферазы был клонирован x оперон из i 1. В работе решались задачи, имеющие значение в области регулирования экспрессии генов, как. протеазы на регуляцию экспрессии xрегулона . . . i в качестве биосенсора для анализа РНК интерференции. Актуальна также проблема молекулярной биологии и биофизики фолдинг и рефолдинг белков и роль белков шаперонов в этих процессах. В диссертационной работе для этой цели впервые используются бактериальные люциферазы. Цель и задачи исследовании Цель настоящей работы заключалась в изучении структуры x оперонов различных люминесцирующих бактерий и конструирования на их основе специализированных биосенсоров. i ii в клетках . протеазы с помощью x оперона . РНК, антипараллельной и параллельной 5фрагменту мРНК гена I, на синтез протеазы с помощью x оперона . Причина тому одна видоспецифические межклеточные сообщения гомосерииа в качестве химических сигналов. Хотя, конечно, подобные межклеточные взаимодействия имеют место и в группе грамположительных бактерий, а в качестве химической основы языка используются также пептиды, модифицированные пептиды, аминокислоты и сходные с ними аминные соединения Дебабов В. Г., Олескин . . и др. По примеру впервые обнаруженной и к настоящему времени подробно описанной ихсистемы типа i у морских бактерий i ii . . . . Ix . . . . В морской воде плотность клеток . Но при достижении популяцией высоких плотностей выше 9 клетокмл, что происходит при росте культуры в богатых лабораторных средах или в светящихся органах головоногого моллюска природная экологическая ниша для этого вида морских бактерий гены xоперона начинают экспрессироваться, что приводит к резкому возрастанию свечения. Свечение ночных животных головоногих моллюсков обеспечивает им сравнительную безопасность, предохраняя от атаки хищников снизу, из глубин океана свечение имеет схожесть с лунным светом, в результате чего тело моллюска теряет тень. Вперые полный шрегулон . .i и детально анализирован в работе . На рис. . . V ШЯк с I 1 I В . РИС. I. Организация опсронов . V, V. Vi, . XI. Регулон состоит из двух оперонов x с промотором i и I с промотором р,, i Е. А., . Структурные гены xАВ определяют синтез а и Р субъединиц люциферазы. Гены ихСОЕ определяют синтез трехсубъединичной редуктазы жироной кислоты i , ведущей восстановление жирной кислоты до альдегида тетрадсканаль, являющегося субстратом люциферазы. Ген Ix определяет синтез т. i Е. А., . С., . Гены xI и x являются регуляторными. РИС. Структуры автоиндукторов АИ у бактерий. . V. . .