Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Киктев, Денис Александрович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 185 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ФАКТОРЫ ТЕРМИНАНДИ ТРАНСЛЯЦИИ.

1.1. Факторы терминация трансляции прокариот.

1.1.1. Прокариотические факторы терминации трансляции I класса

1.1.2. Прокариотические факторы терминации трансляции II класса

1.2. Факторы терминация трансляции эукариот

1.2.1. Эукариотические факторы терминации трансляции I класса

1.2.1.1. Общая характеристика фактора еКР1.

1.2.1.2. Характеристика Идомена сЩ

1.2.1.3. Характеристика Мдомена еКБ 1.

1.2.1.4. Характеристика Сдомена сЮН.

1.2.2. Эукариотические факторы терминации трансляции II класса
1.2.2.1. Общая характеристика фактора еИРЗ.
1.2.2.2. Структурная организация и функции Бир фактора еКБЗ дрожжей сегеуяае
а Общая характеристика БирЗб
б Характеристика Идомена БирЗб.
в Характеристика Мдомена 8ир.
г Характеристика Сдомена Бир.
1.2.2.3. Взаимодействие факторов еИР и еИРЗ с другими белками.
а Взаимодействие факторов еМЧ и еИРЗ между собой
б Взаимодействие факторов терминации трансляции с другими белками
1.2.2.4. Эффекты мутаций в генах Р и 5СР
1.2.2.5. Р5Г прионная форма Бир
а Доказательства прионной природы РБ.
б Структура прионных агрегатов
в Факторы, влияющие на поддержание фактора Р5Р
Влияние НБрЮ4 на Р5.
Влияние шаперонов семейства Нзр и их кошаперонов на Р5.
г Вариабельность РБ .
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы.
2.2. Плазмиды.
2.3. Среды и условия культивирования
2.4. Генетические методы
2.4.1. Индукция Р
2.4.2. Элиминация фактора Р5Д.
2.4.3. Тест на доминантность рецессивность
2.4.4. Оценка частоты потери плазмид
2.5. Молекулярногенетические и биохимические методы
2.5.1. Измерение активности ргалактозидазы.
2.5.2. Измерение активности люциферазы
2.5.3. Получение антител к 8ир
2.5.4. Работа с белками.
2.6. Статистические методы
2.7. Методы компьютерного анализа.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Фактор Р несовместим с мутациями 8иру находящимися в гетероаллельном состоянии
3.2. Фактор Р несовместим с мутациями яир, находящимися в гетерозиготном состоянии.
3.3. Фактор РТ совместим с нонсенсмутациями яир, находящимися в гетерозиготном состоянии.
3.4. Попарное скрещивание клеток РБГ штамма
и клеток мутанта эир
3.5. Изучение несовместимости фактора Р5Д и мутаций зир в тетрадном анализе
3.6. Изучение несовместимости фактора Р и мутаций вир при замещении плазмид
3.7. Факторы, влияющие на несовместимость.
3.7.1. Влияние дополнительных копий 1Р на несовместимость фактора Р5Д и мутаций зир
3.7.2. Влияние мутантных тРНК на несовместимость Р5 и мутаций зир
3.7.3. Влияние БирС на несовместимость фактора РБ и мутаций Бир
3.8. Взаимосвязь уровня супрессии нонсенскодонов в аллелях Бирп и несовместимости с фактором Р5Д.
3.8.1. Характеристика супрессорной активности фактора Р5Д и мутаций зирп
3.8.2. Факторы, определяющие супрессию в использованных штаммах дрожжей
3.8.3. Влияние нуклеотидного контекста на прочтение нонсенскодона в аллелях Бирп
3.8.4. Мутации зирп расположены в умеренном контексте
3.8.5. Мутации зирп расположенные в контексте, облегчающем супрессию, совместимы с фактором РЗ4.
3.8.6. Некоторые аминокислотные замены снижают стабильность белка
3.9. Поиск генов, влияющих на несовместимость Р и мутаций Бир.
3.9.1. Влияние белковшапероиов на несовместимость Р5У и мутаций ьир.
3.9.2. Влияние РАВ1 на несовместимость Р5У4 и мутаций зир.
3.9.3. Тестсистема для поиска генов, влияющих на несовместимость Р5Р и мутаций эир.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Несовместимость характерна как для сильного, так и для слабого фактора
4.2. Взаимосвязь несовместимости и уровня супрессии.
4.3. Количество белка , вероятно, является основным фактором, определяющим несовместимость
4.3.1. Дополнительная копия гена компенсирует несовместимость.
4.3.2. Влияние гена 5Р на несовместимость имеет дозовый эффект.
4.3.3. Несовместимость нонсенсмутаций ьир с фактором Р5.Г определяется снижением количества полноразмерного белка Бир.
4.3.4. Нуклеотидный контекст мутаций 8ир как фактор, определяющий уровень нонсенссупрессии и несовместимость с детерминантом Р
4.3.5. Синтез полноразмерного белка 8ир в отсутствии мутантных тРНК
4.3.6. Несоответствие уровня супрессии нонсенскодонов и количества белка 8ир у нонсенсмутантов Бир
4.3.7. Роль фактора РЗУ в несовместимости.
4.3.8. Несовместимость РХГ и мутаций зир как основа тестсистемы для поиска генов, влияющих на несовместимость.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Противоречие удалось снять два года спустя благодаря использованию метода криоэлектронной микроскопии . II данным, полученным с помощью этого метода, молекула 2 способна претерпевать значительные конформациоиные перестройки и принимать форму, соответствующую модели молекулярной мимикрии. По предложенной авторами гипотезе . Рис. А, которая соответствует структуре полученной ранее при рентгеноструктурном анализе V . В такой конформации 2 способен к слабому связыванию с рибосомой. Бхли при взаимодействии 2 с рибосомой в аминоацильном сайте будет находиться стопкодон мРНК, 2 переходит в открытую конформацию Рис. БРР и ввО составляет А, т. Рисунок 2. Трехмерная структура фактора 2 . А и методом криоэлектронной микроскопии Б . Римскими цифрами отмечены домены белка. Цветом выделены консервативные участки белка. Также отмечено положение мотива и трипептида . Указано расстояние в ангстремах между этими элементами в обеих структурах. Прокариотические факторы терминации трансляции II класса. Роль прокариотического фактора терминации 3 до сих пор остается до конца не выясненной. Ген , кодирующий фактор 3, не является жизненно важным, однако его инактивация приводит к усилению нонсенссупрессии. Вместе с тем сверхпродукция 3 равно как и 1 или 2 приводит к повышению эффективности терминации трансляции . I, . В экспериментах i vi было показано, что присутствие 3 . РНК в участке и стопкодона в участке. Также, белок 3 не влияет на скорость гидролиза пептидилтРНК и освобождение синтезированного белка. На основании ряда данных можно предполагать, что одной из функций фактора 3 может быть освобождение 1 и 2 из рибосомы после гидролиза пептидилтРНК i , . Более точно механизм этой реакции удалось раскрыть в работе Завьялова с коллегами viv . Было показано, что 3 связывается с рибосомой в комплексе с ГДФ, и только после осуществления гидролиза пептидилтРПК. Далее I класса действует как фактор обмена гуаниновых нуклеотидов, стимулируя обмен ГДФ, находящийся в комплексе с 3, на ГТФ. В результате конформационных перестроек в структуре 3 и рибосомы происходит вытеснение фактора терминации I класса из рибосомы. На следующем этапе ГТФ, связанный с 3, гидролизуется до ГДФ и 3 теряет сродство к рибосоме. Конформационные перестройки комплекса терминации, сопровождающие последний этап этого процесса, были детально описаны в работе Гао с соавторами . Таким образом, по существующей на сегодняшний день модели, фактор 3 отвечает именно за освобождение факторов 1 и 2 из Аучастка рибосомы после осуществления реакции терминации. В вовлечении в новые раунды трансляции рибосом у прокариот участвует еще один белок от i i , кодируемый жизненно важным геном i . Факторы тсрминацня трансляции эукариот. Эукариотические факторы терминации трансляции класса. Общая характеристика фактора . У эукариот найден только один фактор герминации трансляции I класса, обозначенный как . Этот белок способен опознавать все три стопкодона и катализирует гидролиз связи между тРНК и поли пептидной цепью, в результате чего происходит освобождение полипсптидпой цепи. Факторы высоко консервативны и характеризуются высокой степенью гомологии даже у эволюционно далеких видов v . Консервативность факторов подтверждается не только структурным сходством, но и функциональной взаимозаменяемостью из разных организмов, принадлежащих к эволюционно далеким группам. Так, дрожжей . X vi , или на человека или китайского хомячка . У дрожжей . В более поздних работах ген был клонирован Сургучсв и др. Последовательность гена содержит пар нуклеотидов и кодирует 7 аминокислотных остатков, что соответствует полипептидной цепи молекулярной массой кДа. На основе данных ренгеноструктурного анализа фактора человека , было показано, что по трехмерному строению молекула напоминает молекулу тРНК Рис. Расстояние между пептидилтрансферазным центром и высококонсервативным участком, в котором предположительно располагается белковый антикодон см. А, что соответствует расстоянию между антикодоном тРНК и псптидилтрансферазным центром А.