Создание коллекции инсерционных мутантов и идентификация генов, контролирующих морфогенез у Arabidopsis thaliana

• Автор: Томилова, Наталья Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 245 с. : ил

Благодаря разработанной технологии пулирования и субпулирования ДНК а также высокой чувствительности используемого метода ПЦР, для скринирования по генотипу трансформантов с целыо отбора индивидуальной мутации в интересующем гене необходимо провести выделение мнннпрспаратов ДНК и поставить индивидуальных полимеразно цепных реакций . При этом, если искомая мутация в тестируемой выборке отсутствует или инсерция имеет обратную ориентацию, отрицательный результат будет получен уже после первой реакции, в которой тестируется суммарная ДНК всего пула из растений. Таким образом, при переходе к каждой повой паре праймеров количество ПЦР будет увеличиваться всего на одну реакцию. С увеличением исходной выборки трансформантов, в которой проводится отбор по генотитгу. Так, при тестировании независимых линий трансформантов индивидуальное растение, несущее мутацию в исследуемом гене СРК2, кодирующем протсинкиназу, было отобрано после проведения всего реакций . Ограниченность данного подхода отбора по генотипу на ранних этапах его применения была связана с недостаточной изученностью структуры генов, их организации в семейства и численности внутри отдельных семейств. Современный этап исследования организации генома различных организмов и, в частности, . Сегодня можно подобрать праймеры к любому интересующему гену или группе генов. Таким образом, ограниченность отбора по генотипу определяется лишь методологическими трудностями ограниченными возможностями иисерционного мутагенеза . ПЦР, заключающимися в эмпирическом подборе праймеров и режимов проведения реакции и амплификации больших фрагментов ДНК . В настоящий момент, когда получены обширные коллекции инсерцнонных мутантов . Сегодня к широкому спектру генов разработаны системы праймеров, которые являются коммерчески доступными . По сравнению с ранними работами, когда расшифровывались функции отдельных генов . Так, МакКиней с коллегами в г. При тестировании линий трансформантов, несущих приблизительно инсерций Т ДНК, пулами но 0 индивидуальных растений с помощью вырожденных актиновых праймеров и праймеров, подобранных к бордерам Т области, были отобраны мутации в двух актиновых генах из известных для . Используя иерархическую пудовую стратегию, когда отбор производится от пулов к составляющим их субпулам ДНК трансформантов, и ДНК линий трансформантов, Крмзан с коллегами обнаружил инссрции Т ДНК в из проанализированных генах, вовлеченных в сигнальную трансдукцию и транспорт ионов . Мсйсснер с соавторами сообщил об идентификации инсерций в из тестируемых генах семейства ДНК связывающих факторов транскрипции в коллекции инсерционных мутантов, полученных с помощью ТДНК и транспозонов i . Однако, как использование методов прямой, так и обратной генетики в данном случае требует создания коллекции трансгенных растений, геном которых имеет инсерцию мобильных элементов или ТДНК. Инсерционный мутагенез. ДНК. Однако, как правило, речь идет о последовательностях, имеющих определенную структуру. Наибольшие успехи достигнуты при использовании природных инсерционных агентов , , . Подвижные генетические элементы растений, причм мутационные свойства таких мобильных элементов используются и при искусственном введении их в геном растений, таких элементов не имеющих , . Тобласть i и i плазмид почвенной агробактерии i i, природная система переноса генов которой получила чрезвычайно широкое распространение при создании векторов для трансформации двудольных растении , , iI. Наиболее изученными видами растений, содержащими эндогенные мобильные элементы, являются кукуруза, львиный зев, петуния, табак. У кукурузы, табака и петунии мобильные элементы связаны с соматической мутационной нестабильностью. Для этих видов показано существование регуляторных генетических элементов, влияющих на поведение этой нестабильности и действующих в транс положении i, , iii . У львиного зева обнаружен ряд подвижных элементов , , . Такие системы создаются на базе хорошо изученных систем мобильных элементов кукурузы активатор диссоциатор iv . Еп I энхансер ингибитор . Система инсерционного мутагенеза на базе ТДНК ДНК i или i плазмид .