Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках

• Автор: Салехи Джузани Голам Реза
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1. i iii и 6эндотоксины

1.1. Общая характеристика бактерий

1.2. Виды токсинов, образующихся в бактериях

Классификация штаммов и сугенов .

1.4. Частные вопросы генетики и молекулярной биологий .

2. Экспрессия сугенов и синтез протоксинов.

2.1. Транскрипционные механизмы

2.2. Посттранскрипционные механизмы

2.3. Посттрансляционные механизмы

2.4. Кристаллизация инсектицидных белков.
2.5. Структура 2гтоксинов
2.6. Структурные сходства среди токсинов.
2.7. Функционально структурная интерпретация 2токсинов
3. Механизм действия токсинов
3.1. Общая характеристика
3.2. Роль петель домена II.
3.3. Роль домена III в закреплении рецептора.
3.4. Интеграция в мембрану.
3.5. Образование ионных каналов
3.6. Получение мутантов для повышения токсичности
4. Использование генов в биотехнологии и генной нженерии.
4.1. Использование белков для контроля численности вредителей и защиты растения
4.2. Разработка новых биопестицидов, основанных на
4.3. Экспрессия сугенов в растениях.
4.4. Устойчивость насекомых к токсинам
4.5. Управление устойчивостью насекомых к 2токсинамб
5. Новые репортерные системы на основе лихеназы ii
Глава II. Материалы и методы
Глава III. Результаты и обсуждение
Заключение
Выводы
Слисок цитируемой литературы
Список сокращений и обозначений
ПААГ ДСНПААГ гельэлектрофорез в денатурирующих условиях ЭДТА этилендиаминтетраацетат
I i I ферментный иммуносорбентный метод
АТФ аденозинтрифосфат
ргалактозидаза
X 5бромо4хлоро3индолилр0галактозид
ИПТГ изопропилгалактопиронозид
промотор II вируса мозаики цветной капусты
промотор малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы
или конститутивный промотор глицсральдегид3фосфат дегидрогеназы дрожжей
1 индуцибельный галактокиназный промотор дрожжей рА область полиаденилирования а.о. аминокислотные остатки
i полноразмерная лихеназа ii
ДСН додецилсульфат натрия
ПЦР полимеразная цепная реакция
ИУК индолилуксусная кислота
МС среда МурасигеСкуга
МТ микротрубочки
Сгу кристаллические белки, кодируемые бактериями бактерия i iii
Эндотоксины кристаллические белки, кодируемые в бактериях
Экзотоксин неспецифичные термостабильные токсины, кодируемые в бактериях
цитолитические токсины
СгуЗаМ синтетический ген сгуЗа с модифицированной последовательностью VI эндотоксины, экспрессирующиеся во время стадии роста бактерии V vi аминопептидаза
анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов I инсерционная последовательность
двухслойная плоская липидная система ii i
среднесмертельная концентрация
Введение


Несмотря на многочисленные исследования, этот вопрос пока не до конца разработан. В связи с этим разработка новых подходов, позволяющих производить такие исследования быстро, точно и с минимальными затратами является актуальной. Цель исследования провести сравнительное изучение экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЗа в клетках про и эукариот. Клонирование нативного гена сгуЗа, определение его нуклеотидной последовательности и анализ последовательности сгуЗа гена. Модификация последовательности гена сгуЗа с помощью компьютерных программ для эффективной экспрессии в клетках эукариотах дрожжи и растения. Химический синтез и клонирование фрагментов модифицированного гена с последующей проверкой корректности сборки последовательности модифицированного гена сгуЗаМ секвенированисм. Конструирование бактериальных и дрожжевых экспрессионных векторов, в которых нативный и синтетический гены слиты с новым универсальным репортерным геном сВМ2, кодирующим термостабильную лихеназу. Сравнительное изучение экспрессии нативного, модифицированного и гибридных генов в клетках . Проведение биотсстов на личинках первого возраста колорадского жука i ii с использованием белковых экстрактов, полученных из дрожжевых трансформантов. Конструирование растительных экспрессионных векторов, в которых сгуЗаЪЛ и гибридный сгуЗаЫИсВЫ2 гены находятся под контролем светонндуцибильного промотора малой субъединицы гена РБФК ii i и последовательности лидериого пептида гена РБФК гороха. Получение и . ЗаМ и сгуЗаМНсВЬЛ2 гены. Проведение биотестов первичных трансформантов растений картофеля, экспрессирующих сгуЗаЫ и сгуЗаМсВМ2 гены, с использованием личинок колорадского жука. Научная новизна работы. СгуЗа в клетках про и эукариот. Показано, что термостабильная лихеназа может использоваться в качестве удобного репортера для отбора трансгенных организмов, определения молекулярной массы гибридных белков и уровня их экспрессии. Для эффективной экспрессии в клетках эукариот ген сгуЗа сгуЗаМ был модифицирован, и проведены его синтез и клонирование с использованием новой стратегии. Показано, что модификация последовательности сгуЗа гена позволила значительно увеличить уровень его экспрессии в клетках эукариот дрожжи, растения с сохранением биологической активности белкового продукта. Впервые для экспрессии модифицированного сгуЗаМ и гибридного сгуЗаМсВМ2 генов в растениях картофеля был использован свстоиндуцибильный промотор малой субъединицы гена РБФК ii i, который обусловливает преимущественную экспрессию контролируемого им гена только в зеленых тканях растения листьях органахмишенях для личинок колорадского жука. Апробация результатов работы. I , i i, 4 Ii I i i , I, 3 ii iii i i i i, vi , i, Ii iii i, i i i, , Ii i Ii i, i, Международной конференции Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции , , III съезде ВОГиС Генетика в XXI веке, Современное состояние и. Москва, Россия, Международной конференции Клеточные ядра и пластиды растений биохимия и биотехнология i, , II Конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова Актуальные проблемы генетики Москва, Россия, Конференции, посвященной 0летию научной селекции в России Москва, Россия, на заседании научного семинара Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и на семинарах лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Глава I. В году Iiv в Японии и i в Германии изолировали из мертвых личинок шелкопряда и вредителя муки Ii и охарактеризовали их как энтомопатогены, поскольку они содержали параспоральные кристаллы, которые обладали инсектицидным действием. Современные данные свидетельствуют о том, что некоторые подвиды продуцируют токсины, имеющие инсектицидное действие против других порядков насекомых перепончатокрылых, равнокрылых, прямокрылых и пухоедов, а также против нематод, клещей и простейших. Помимо этого является ключевым источником генов для переноса их в растения с целью обеспечения устойчивости к вредителям. В г.