Анализ экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов в процессе раннего развития вьюна (Misgurnus fossilis L. )

• Автор: Ильичев, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

Введение

Обзор литературы

Часть 1. Трансгенные рыбы

1. Рыбы, как модельный объект исследований Методы трансгеноза рыб.

2. Судьба чужеродной ДНК

3. Экспрессия чужеродного генетического материала в

процессе эмбрионального развития.

4 Экспрессия чужеродных генов в культуре клеток

5. Практическая ценность трансгенных рыб.

Часть 2. Структура эукариотического промотора

механизмы регуляции активности промоторов

Материалы и методы.
1. Получение рекомбинантных векторных молекул ДНК.
1.1. Трансформация клеток Е. соН.
1.2. Выделение ллазмидной ДНК из Е. соН
1.3.Очистка ллазмидной ДНК.
1.4. Рестрикция
1.5. Электрофорез в полиакриламидном геле
1.6. Препаративный электрофорез в агарозном геле и
выделение ДНК
1.7. Лигирование ДНК.
1.8. Отжиг синтетических олигонуклеотидов
1.9. Включение метки в 5кснцы ДНК с помощью
полинуклеотидкиназы фага Т4
Приготовпение сефадекса .
1 Гибридизация i i бактериальных колоний Е со.
Скрининг небольшого числа колоний.
Связывание высвобождающейся ДНК.
Предгибридизация
Гибридизация
1 Достраивание укороченных Зконцов двухцепочечной ДНК.
2. Эксперименты на вьюнах i ii
2.1. Стимуляция созревания ооцитов и получение
оплодотворенной икры.
2.2 Микроинъекции ДНК в зиготы вьюна
2.3. Определение активности ргалактозидаэы.
Результаты и их обсуждение
1. Создание рекомбинантных векторных молекул, предназначенных для анализа экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов.
1 а Создание серии рекомбинантных векторных молекул ДНК
на основе маркерного гена .
Получение рекомбинантных векторных конструкций
на основе маркерного гена .
2 Анализ экспрессии чужеродного генетического материала в процессе
раннего развития вьюна i ii .
2а Анализ экспрессии векторных конструкций
первой серии рис. I.
Анализ экспрессии векторных конструкций
второй серии рис. II
3. Анализ влияния БАКдомена лактозного оперона . i на экспрессию маркерного гена под контролем эукариотического промотора в
процессе раннего развития вьюна i ii.
Список литературы


Следует отметить, что исследование механизмов регуляции экспрессии генов, их регуляторных элементов не только расширит наше представление о структуре функциональной активности генов, но и позволит использовать полученные знания в биотехнологии, являющейся на сегодняшний день одной из самых перспективных отраслей промышленности. В соответствии со сказанным выше были сформулированы следующие основные задачи данного исследования. Создание векторных молекул, которые могут быть использованы для трансгеноза различных видов организмов и проведения сравнительного анализа эффективности экспрессии чужеродного генетического материала под контролем гетерогенных промоторов. С этой целью представлялось актуальным конструирование нескольких серий рекомбинантных векторных молекул ДНК, содержащих маркерные гены и под контролем сильных промоторов, клонированных из ДНК организмов, принадлежащих эволюционно отдаленным таксонам. Анализ эффективности экспрессии созданных векторных конструкций в процессе раннего развития вьюна i ii . Изучение влияние бактериальных последовательностей ДНК, в частности, БАКдомена лактозного оперона Е. Обзор литературы. Часть 1. Трансгенные рыбы. Рыбы, как модельный объект исследований. Методы трансгеноза рыб. Активное использование трансгенных рыб в научных исследованиях началось не так давно, чуть более десяти лет назад . К настоящему моменту количество видов рыб, используемых в работах по трансгенозу, сильно увеличилось. Эти виды включают в себя атлантического лосося , радужную форель i i, карпа i i, тиляпию i ii. x i и др. Исследования по трансгенозу ведутся не только с промысловыми видами рыб, но и на видах, малоценных в пищевом отношении золотой рыбке i , вьюне i ii, медаке i i, даниорерио i . Использование рыб в качестве трансгенных систем имеет ряд преимуществ по сравнению с другими позвоночными. К таким преимуществам относятся внешнее оплодотворение, высокая плодовитость самка даниорерио откладывает 00 икринок, некоторые лососевые 5 тыс икринок, карп более 0 тъгс. . Ниже перечислены методы, наиболее часто применяющиеся при трамсгенозе рыб. Электропорация эмбрионов, находящихся на ранней стадии развития I К . Обстрел ооцитов рыб микрочастицами вольфрама, несущими чужеродную ДНК Колесников А. Перенос генов с помощью липосом i . Прямой перенос трансгенов в сперматозоиды рыбы . Микроинъекция . . . . . Ниже будут более подробно рассмотрены методы переноса чужеродного генетического материала посредством сперматозоидов и метод микроинъекций. Прямой перенос трансгенов в сперматозоиды рыбы. i. Оплодотворение облученными привело к активации яйцеклетки и сохранению второго полярного тела. Особи, выжившие после вышеописанной манипуляции, были, в большинстве своем, мозаиками по пигментации, содержали диплоидный набор материнских хромосом и некоторое количество отцовских минихромосом. В третьем поколении менее особей радужной форели имели пигментацию. Вероятно, у многих особей минихромосомы утрачивались при мейозе или ранее при митозах. Тем не менее, пигментация тел окрашенных особей составляло не менее . Цитологическое исследование метзфазных пластинок пигментированной трансгенной радужной форели третье поколение подтвердило наличие непарных минихромосом . . . Микроинъекция. Микроинъекция это один из самых распространенных способов получения трансгенных рыб. Метод достаточно прост. Чужеродная ДНК вводится в эмбрион с помощью стеклянной микропипетки, которая пронзает хорион и плазматическую мембрану, при этом содержимое микропипетки выбрасывается внутрь клетки. После подобной операции выживают от до эмбрионов О. . . . . . При этом увеличение количества ДНК, вводимого в цитоплазму эмбриона форели, приводит к сильному понижению их выживаемости . Уменьшение количества ДНК приводит к повышению выживаемости, но понижает вероятность успеха переноса генов . . . .