Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха

• Автор: Ковеза, Оксана Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные маркеры и их использование для исследования генома растений

1.2. ПДРФмаркеры.

1.3. Полимеразная цепная реакция

1.4. ДНКмаркеры, основанные на полимеразной цепной реакции

1.5. Использование метода в исследовании генома растений

1.6. маркеры и проблемы, связанные с их получением.

1.7. Системы обнаружения известных точковых мутаций.

1.8. Генетическая карта посевного гороха i iv ..
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Характеристика растительного материала.
2.2. Получение гибридов 1 и расщепляющихся популяций 2
2.3. Выделение тотальной ДНК из листьев гороха
2.4. Метод ГТЦР с использованием коротких случайных праймеров метод
2.5. Клонирование фрагментов.
2.5.1. Получение ДНКфрагментов для клонирования
2.5.2. Лигирование фрагментов ДНК с вектором.
2.5.3. Приготовление компетентных клеток .i.
2.5.4. Трансформация .i штамм 9 плазмидной ДНК
2.6. Метод выделения плазмидной ДНК.
2.7. Анализ векторной ДНК на наличие требуемых вставок
2.8. Секвенирование клонированных фрагментов
2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей
2 Создание маркеров
21 .Подбор праймеров для амплификации специфических фрагментов ДНК.
22.Реакция амплификации с использованием праймеров.
23.Подготовка ПЦРфрагменгов для рестрикции.
24.Рестрикция ПЦРфрагментов
2 Массовый сегрегационный анализ
2 Математическая обработка данных.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Картирование гена Ха у гороха с помощью морфологических маркеров
3.2. Выявление маркеров в ДНК гороха.
3.3. Изучение наследования полиморфных фрагментов
3.4. Количественная оценка полиморфизма и построение дендрограмм.
3.5. Поиск маркеров, сцепленных с некоторыми генами гороха
3.6. Создание и изучение маркеров
3.6.1. Получение маркера из К0 фрагмента
3.6.2. Получение маркера из В40 фрагмента.
3.6.3. Получение маркера из фрагмента.
3.6.4. Получение маркера из Рг0 фрагмента.
3.6.5. Получение маркера из К80 фрагмента.
3.6.6. Получение маркера из Е 0 фрагмента.
3.6.7. Получение маркера из 0 фрагмента.
3.6.8. Получение маркера из В40 фрагмента
3.6.9. Получение маркера из 1 0 фрагмента.
3.6Получение маркера из Рг0 фрагмента.
3.6. .Получение маркера из 60 фрагмента
3.6Получение маркера из Рг0 фрагмента.
3.6Получение маркера из 0 фрагмента
3.6Получение маркера из V0 фрагмента
3.7. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов,
использованных для получения маркеров
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Тотальную ДНК растения подвергают обработке ферментом рестрикционной эндонуклеазой. Рестриктаза узнает в ДНК строго определенную последовательность нуклеотидов. Поэтому, несмотря на то, что в результате такого гидролиза ДНК нарезается с образованием множества фрагментов самой разной длины, набор фрагментов, полученных из ДНК данного растения с помощью данной рестриктазы является всегда постоянным по количеству фрагментов и по их величине. Эти фрагменты ДНК разделяют в агарозном или полиакриламидном геле, денатурируют, а затем переносят на фильтр специальным образом обработанную бумагу, нитроцеллюлозу или нейлон. При переносе на фильтр относительные положения фрагментов ДНК на геле сохраняются. Зафиксированные на фильтре фрагменты ДНК подвергают гибридизации с радиоактивно меченным зондом. В качестве зонда обычно используют кДНК или фрагменты геномного рестрикта . i . . i . Шишкин, Калинин, . Благодаря тому, что нуклеотидные последовательности радиоактивно меченного зонда специфически связываются с комплементарными последовательностями фрагментов, зафиксированных на фильтре, положения данных фрагментов, после отмывки несвязавшейся с фильтром метки, можно выявить путем экспозиции с рентгеновской пленкой Маниатис и др. Шишкин, Калинин, . Полиморфизм при этом обнаруживается как изменение положения фрагментов по сравнению с контролем, исчезновение старых и появление новых фрагментов. В основе возникновения ПДРФ лежат вариации в последовательности ДНК. Вследствие точковых мутаций, делений, инсерций, инверсий, транслокаций могут появляться и исчезать сайты узнавания рестриктаз, меняться расстояния между сайтами, что приводит к изменению набора рестрикционных фрагментов Калинин и др. ii, . Кроме того, некоторые рестрикционные эндонуклеазы неспособны резать ДНК, если последовательность узнавания содержит один или несколько метилированных цитозиновых остатков. Следовательно, такие ферменты могут обнаружить ПДРФ, если имеется вариация в характере метилирования цит. Малышев, Картель, . ПДРФмаркеры были широко использованы в создании генетических карт сцепления у разнообразных организмов. Генетические карты с использованием ПДРФ получены для таких растений, как подсолнечник i . i а . . ii, v , , картофель . i . i . Хлесткина и др. i . . Ежова и др. . i . . ПДРФмаркеров. ПДРФлокусы могут обладать множественными, легко различимыми аллелями . . ii, . Это является большим преимуществом данного типа маркеров, поскольку ценность маркера в селекционных программах зависит от его возможности сегрегировать в различных скрещиваниях. Вероятность же того, что локус будет сегрегировать и, следовательно, будет информативным, тем больше, чем больше имеется аллелей данного локуса i . ПДРФстратегия применяется также для филогенетических исследований . . i . Высокий консерватизм ПДРФмаркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов. Появление детальных генетических карт многих растений позволило сравнить между собой ряд геномов благодаря использованию общего набора ПДРФзондов . . i . ПДРФанализ успешно используется в ряде генетических исследований растений, животных и человека, таких, как диагностика наследственных заболеваний человека Шишкин, Калинин, Калинин, , идентификация локусов, контролирующих агрономически важные признаки растений ii . x . i . . Однако, несмотря на достигнутые успехи с использованием ПДРФ, эта методика имеет ряд недостатков, к которым относятся использование радиоактивных изотопов, длительность, высокая стоимость и высокая трудоемкость процедуры, а также необходимость больших количеств ДНК и достаточно высокие требования к ее качеству ii . Полимеразная цепная реакция.