Пространственная и функциональная организация локуса Q22.1 хромосомы человека 16, содержащего LCAT генный кластер

• Автор: Шапошников, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Пространственная организация генома человека

1.1. Упаковка генетического материала в клеточном ядре

1.1.1. Нуклеосомный уровень компактизации

1.1.2. Фибрилла диаметром нм

1.1.3. Петельнодоменный уровень компактизации хроматина

1.2. Структура хроматиновых петель

1. 3. Ядерный матрикс

1.4. Методы изучения доменной структуры генома

1.4.1. Экстракция при высокой ионной силе

1.4.2. Iэкстракция
1.4.3. Электроэлюция
1.4.4. Связывание с ядерным матриксом скэффолдом i vi
1.4.5. Расщепление топоизомеразой II ядерного матрикса
1.4.6. Флуоресцентная гибридизация i i
1.5. Петлевые домены и функциональная активность генома
1.5.1. Петлевые домены и транскрипция
1.5.2. Петлевые домены и репликация
1.5.3. Различные типы прикрепления ДНК к ядерному матриксу
2. Картирование геномов
2.1. Физическое картирование генома
2.2. Виды физических карт генома
2.2.1. Цитогенетические карты
2.2.2. Рестрикционные карты
2.3. Вектора, используемые для создания библиотек геномов
2.3.1. Дрожжевые искусственные хромосомы вектора
2.3.2. Векторная система бактериофага Р1
2.3.3. ВАС и РАС вектора
2.4. островки
3. Локус хромосомы человека .1
3.1. генный кластер
3.2. еньсупрессорь рака молочной железы на хромосоме человека
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
1.1. Реактивы
1.2. Ферменты
1.3. Питательные среды
1.4. Библиотеки генома человека
1.5. Пробы, применявшиеся при построении интеграционной карты региона хромосомы человека .1
1.6. Пробы, применявшиеся для флуоресцентной гибридизации i i
2. МЕТОДЫ
2.1. Выделение РАС ДНК
2.2. Субклонирование фрагментов ДНК РАС клонов
2.3. Приготовление геномной ДНК лимфоцитов человека, заключенной в агарозные блоки
2.4. Расщепление заключенной в агарозные блоки ДНК рестриктазами
2.5. Пульс электрофорез
2.6. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр блоттинг
2.7. Радиоактивное мечение фрагментов ДНК
2.8. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом
2.9. Программное обеспечение
2 Выделение лимфоцитов человека для приготовления препаратов ядерного гало и метода ДНКкомет
2 Электрофорез единичных клеток метод ДНКкомет
2 Флуоресцентная гибридизация i i с препаратами ДНКкомет
2 Приготовление препаратов ядерного гало
2 Флуоресцентная гибридизация i i с препаратами метафазных хромосом и препаратами ядерного гало
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Построение интеграционной физической и функциональной карты локуса .1 хромосомы человека
1.1. Картирование представленных в виде геномных библиотек участков
ДНК локуса хромосомы человека .1
1.2. Построение геномной карты локуса
1.3. Локализация принадлежащих локусу островков
1.4. Выявление генов и других функционально значимых элементов
1.5. Использование интеграционной карты локуса хромосомы человека .1 для выявления геновсупрессоров развития рака молочной железы
и других функциональных последовательностей
1.6. Интеграционная карта локуса .1 хромосомы человека как основа
для выявления его доменной организации
2. Исследование доменной организации локуса хромосомы человека .1, содержащего генный кластер
2.1 Комбинирование метода ДНКкомет с флуоресцентной гибридизацией i i в целях изучения петлевой организации хроматина
2.2. Изучение пространственной организации локуса хромосомы человека .1 с использованием комбинации флуоресцентной гибридизации i
i и метода ДНКкомет
2.3. Флуоресцентная гибридизация i i с препаратами ядерного гало
2.4. Флуоресцентная гибридизация i i проб из региона хромосомы человека .1 с препаратами человеческих хромосом
2.5. Флуоресцентная гибридизация i i проб из региона хромосомы человека .1 с препаратами ядерного гало
2.6. Определение позиций индивидуальных последовательностей ДНК
внутри препаратов ядерного гало
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Локус хромосомы человека . Пробы, применявшиеся при построении интеграционной карты региона хромосомы человека . Построение интеграционной физической и функциональной карты локуса . ДНК локуса хромосомы человека . Использование интеграционной карты локуса хромосомы человека . Интеграционная карта локуса . Исследование доменной организации локуса хромосомы человека . Изучение пространственной организации локуса хромосомы человека . Флуоресцентная гибридизация i i проб из региона хромосомы человека . Флуоресцентная гибридизация i i проб из региона хромосомы человека . В последние годы все большую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение взаимосвязи пространственной организации генетического материала в клеточном ядре и функциональной активности генома. Подобный интерес вызван как стремительным развитием молекулярнобиологических методов, позволяющих осуществлять исследования на качественно новом уровне, так и накоплением колоссального количества данных о структуре и функции различных регионов генома. Выявление закономерностей пространственной организации этих регионов в соответствии с их функциональной значимостью может оказаться ключевым в понимании общей картины реализации генетической информации в клетках эукариот. Компактная упаковка генетического материала эукариот в ограниченном объеме клеточного ядра осуществляется в несколько этапов. Основными уровнями конденсации хроматина являются нуклеосомы, нм фибрилла и петельнодоменный уровень конденсации. С точки зрения функциональной активности генома, особый интерес представляет именно третий уровень компактизации ДНК, на котором нм фибрилла хромосомной ДНК образует петли, закрепленные на скелетных структурах ядра. Считается, что существует прямая корреляция структурной организации генома в виде петель и его разделения на ряд относительно независимых функциональных доменов i, , i, i V, . Такими доменами, прежде всего, являются единицы транскрипции транскриптоны, и единицы репликации репликоны. Участкам прикрепления петель к скелетным структурам ядра соответствуют различные регуляторные элементы, имеющие критическое значение для функционирования генома. Обнаружить подобные элементы, основываясь только на данных о первичной структуре участков ДНК, содержащих эти элементы, практически невозможно. В каждом конкретном случае необходимо применение соответствующих экспериментальных подходов. Настоящая диссертационная работа посвящена изучению функциональной и пространственной организации локуса . Этот кластер генов является одним из наиболее компактных описанных в литературе кластеров генов млекопитающих и включает в себя ген протеасомной субъединицы 1, химотрипсинподобной протеазы 1, протеинсериновой киназы 1, лецитинхолестерол ацил трансферазы и ген 4, кодирующий I котранспортер. Все пять генов расположены внутри фрагмента ДНК длинной тысяч пар нуклеотидов . Было показано, что гены, составляющие генный кластер, не имеют гомологии нуклеотидных последовательностей и не связаны между собой функционально. Тем не менее, структура кластера практически не менялась в процессе эволюции. Аналогичные кластеры генов были обнаружены в геноме у рыбы и свиньи . По всей видимости, организация данного кластера генов не случайна и имеет биологическое значение. Выявление взаимосвязей доменной структуры хроматина в районе генного кластера с функциональной активностью может способствовать объяснению биологического смысла столь компактной организации генов, составляющих генный кластер. Регион человеческой хромосомы .