Изучение структурных и функциональных нарушений Х-хромосомы, приводящих к различным формам Х-сцепленной умственной отсталости

• Автор: Стрельников, Владимир Викторович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распространенность умственной отсталости

1.2. Клиническая характеристика, особенности наследования

и молекулярногенетические основы синдрома МартинаБелл

1.2.1. Клиническая характеристика синдрома МартинаБелл

1.2.2. Цитогенетические основы СМБ.

1.2.3. Трудности диагностики СМБ.

1.2.4. Особенности наследования СМБ. Парадокс Шермана

1.2.5. Молекулярногенетические основы СМБ.
1.3. Клиническая характеристика, цитогенетические и молекулярногенетические основы УО ШАХЕ и ЕЯАХ
1.3.1. Клиническая характеристика и цитогенетические основы УО 4Е и ЕИ4ХЕ.
1.3.2. Молекулярногенетические основы УОЯШЕиЯШГ.
1.4. Роль импринтинга и эффекта положения в развитии
СМБ и УО ШАХЕ.
1.5. Молекулярные основы хромосомной ломкости
1.5.1. Типы ломких участков
1.5.2. Молекулярная структура ломких участков
1.5.3. Регуляция экспрессии фолатчувствительных ломких участков.
1.6. Нестабильность тринуклеотидных повторов.
1.6.1. Болезни экспансии тринуклеотидных повторов
1.6.2. Механизмы экспансии тринуклеотидных повторов
1.6.3. Влияние хромосомного окружения на стабильность тринуклеотидных повторов. Гопуляционая генетика СМБ и УО ГНАХЕ
1.7. Гиперметилирование амплифицированных ССОповторов.
1.7.1. Механизмы гипермстилнрования СОСновторов.
1.7.2. Реализация эффектов метилирования СООповторов
1.8. Методы ДНКдиагностики СМ Б. УО ЕКАХЕ и ГЯАЛТ
1.8.1. ДНКдиагностика СМБ.
1.8.2. ДНКдиагностика УО ЕКЛХЕ и ЕИАХТ
1.9. Резюме.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Обследование больных.
2.2. Забор венозной крови
2.3. Цитогенетическая диагностика СМБ.
2.4. Выделение геномной ДНК.
2.5. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
и элекрофорез при проведении блотгибридизации
2.6. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом.
2.7. Полимеразная ценная реакция ПЦР
2.7.1. ПЦР полиморфных областей микросателлитных маркеров.
2.7.2.ЦР фрагментов СрОостровков
2.7.3. Амплификация фрагмента гена 5У.
2.8. Автоматический сиквенс.
2.9. Программное обеспечение компьютерного анализа
последовательностей ДНК.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Цитогенетическая и ДНКдиагностика СМБ.
3.1.1. Цитогенетическое выявление фолатчувствительных ломких участков
3.1.2. Детекция экспансии тринуклеотидного повтора СО С методом блотгибридизации.
3.1.3. Анализ метилирования СрОостровка гена ГМК.
3.1.3.1. Совместный анализ метилирования СрСостровка ЕМЯ1 и экспансии СООповтора.
3.1.3.2. Изолированный тест на метилирование
с использованием блотгибридизации по Саузерну
3.1.3.3. Анализ метилирования с использованием ПЦР .
3.1.3.4. Анализ сцепления в диагностике СМБ.
3.1.4. Совместный анализ метилирования СрОостровков, прилежащих к ломким участкам РЯЛХА, ПЫХЕ и Л4Л7Г.
3.1.5. Пренатальная диагностика СМБ
3.1.6. Сравнительный анализ подходов к ДНКдиагносгике СМБ и УО ШАХИ Современный протокол лабораторной диагностики СМБ
3.2. Стратегия и тактика скрининга на СМБ
3.2.1. Выбор стратегии скрининга на СМБ
3.2.1.1. Выявление женщинносителей СМБ в общей популяции
3.2.1.2. Неонатальный скрининг новорожднных мальчиков
3.2.2. Тактика неонатального скрининга на СМБ
3.3. Изучение механизмов экспансии тринуклеотидных повторов. Современная модель этиопагогенеза СМИ
3.3.1. Гаплотипы ОХЕЯАХАСX3 в контрольной группе и группе больных с СМБ
3.3.2. Анализ наследования аллелей микросателлитных маркров 0X, ЛШЖЛ Е1ЫХАС2,0X1, 0X3, 0X3 и
тринуклеотидного повтора гена андрогенового рецептора в контрольных семьях и в семьях с СМБ
3.3.3. Роль эффекта родоначальника и микросателлитной нестабильности в популяционной генетике СМБ в России.
3.3.4. Современная модель экспансии тринуклеотидных повторов на примереСМБ
Глава 4. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ
ДА акриламид
БД , метилен бис акрил амид ОПР очень поздняя репликация Г1ААГ полиакриламидный гель ПЦР полимеразная цепная реакция СМ Б синдром МартинаБелл У О умственная отсталость
НСУО неспецифическая умственная отсталость X i X Хсцепленная умственная отсталость ЭДТА натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты ЭЭГ электроэнцефалограмма аммония персульфат
X Хсцепленная умственная отсталость с аталассемией
дезоксицитидинтрифосфат
дезокситимидинтрифосфат
I флуоресцентная гибридизация i i
i i i 1 ген У О, ассоциированной с
2 i i i 2 ген УО. ассоциированной с X
белковый продукт гена
X фолатчувствительпый ломкий участок А на Ххромосомс
X фолатчувствительный ломкий участок Е на Ххромосомс
Xфолатчувствительный ломкий участок на Ххромосоме
трисхлоридный буферный раствор, содержащий ЭДТА и глюкозу
1ШАС гистондеацетилаза
I коэффициент умственного развития
МеСР метилсвязывающий белок, продукт гена МеСР
додецилсульфат натрия
0. М хлорид натрия, 0.5 М цитрат натрия ТВЕ тМ трисборат, шМ борная кислота, 2 шМ ЭДТА ТЕ тМ трисНС, 8.0, 1 шМ ЭДТА ТЕМЕБ тетраметилэтилендиамин
Сокращения для распространнных единиц измерения даны в соответствии с общепринятой номенклатурой.
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


Хсцепленная умственная отсталость распространнное патологическое состояние с высокой частотой семейных случаев, что создает предпосылки для эффективной профилактики. Причины мутаций, приводящих к наиболее распространенным Xсцеиленным формам УО, изучены недостаточно, а существующие методы лабораторной диагностики несовершенны, дорогостоящи и не могут быть использованы для широкого скрининга. Молекулярная диагностика мутаций, приводящих к Хсцепленным формам УО, в настоящее время в отечественной лабораторной практике используется недостаточно и малоэффективно. Цель и задачи исследования. Основной целью работы является разработка протоколов диагностики и скрининга распространнных форм Хсцепленной умственной отсталости на основе изучения структурных и функциональных изменений Ххромосомы, приводящих к фенотипу УО. Провести комплексный анализ области расположения генов РМН1, РМ и ломкого хромосомного участка РЯАХР в районе хромосомы Хсф, включающий а блотгибридизационный анализ с использованием внутригенных ДНКмаркеров б анализ метилирования СрОостровков генов РШ1, РИЯ2 и ломкого участка РЯАХР в изучение нормального макроса 1сллитного окружения области РЯАХАРЯАХР. Изучить распределение аллелей динуклеотидных полиморфизмов 0X. П1ЛХЛС1, РРАХАС2, 0X1, 0X2, 0X3 в контингенте нормальных индивидов и в группе больных с СМ В. СМБ в рамках изучения причин экспансии три нуклеотидного повтора СООп в гене . РКЛХА, РКАХЕ и РКАХР для диагностики и скрининга СМБ, УО РКАХЕ. РКАХР и численных аномалий Ххромосомы. Разработать протоколы диагностики и скрининга распространнных форм Хсцепленной умственной отсталости на основе сравнительного анализа существующих и вновь разработанных методик. Научная новизна. Впервые для обследования большой выборки больных с умственной отсталостью, составляющей 0 пациентов, одновременно применены различные методы лабораторной диагностики Хсцепленных форм УО, что позволило сделать выводы о характере структурных и функциональных изменений Ххромосомы, приводящих к развитию фенотипов УО. РХ, РЯАХЛСР РРАХАС2, 0X1, 0X и 0X3 и возможность их использования в косвенной диагностике СМБ и УО ПЫХЕ. Впервые описаны мутации 0X, РКАХАС1 и 0X3. СМБ. Разработаны и апробированы методики анализа функционального состояния генов и РМК2 на основе метилчувствительной ПЦР. Модифицирован протокол диагностики СМБ. Впервые в России проведена успешная молекулярная диагностика УО РКАХЕ. Исследован характер метилирования СрОди нуклеотидов в промоторной области гена РШ2. Предложен алгоритм неонатального скрининга. На основе комплексного анализа области расположения генов ЕММ, ЕМЛ2 и ломкого хромосомного участка ЕЯАХЕ в районе хромосомы Хц предложена современная гипотеза этиологии экспансии тринуклеотидных повторов. Практическая значимость работы. Проведена ДНКдиагностнка у 0 больных с УО и у родственников. В 8 семьях с СМБ исследовано 9 образцов плодного материала в 5 случаях выявлены изменения, характерные для СМБ. В результате выполненного исследования разработаны подходы для молекулярнобиологической диагностики СМБ, УО ШАХЕ и полных мутаций экспансии ЕКАХЕ у больных с умственной отсталостью и диагностики носительства у родственников. Проведен дизайн олигонуклеотидных праймеров для анализа метилирования СрОостровков 7МХА, ГНАХЕ и ЕЯАХЕ. Разработан алгоритм неонатального скрининга мальчиков для выявления больных с СМБ, УО ЕКАХЕ, полных мутаций экспансии ШАХЕ и численными аномалиями Ххромосомы. Социальноэкономическая значимость результатов исследования связана с повышением эффективности лабораторной диагностики, пренатальной диагностикой, ранней диагностикой, скринингом и профилактикой Xсцепленной УО. Положения, выносимые на защиту. Проведн комплексный молекулярногенетический анализ области расположения генов ЕМШ, ЕМК2 и ломкого хромосомного участка ЕНАХЕ в районе хромосомы Хсц в норме и у больных с СМБ, УО ЕИАХЕ. Ххромосомы у мужчин с УО. Разработаны протоколы лабораторной диагностики СМБ, УО ЕКАХЕ и метод диагностики полных мутаций экспансии ЕЯАХТ.