Генетический и молекулярно-биологический анализ функций гена HSM2 в репарации предмутационных повреждений ДНК у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Алексеев, Сергей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 160 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. СИСТЕМЫ ПОДЕРЖАНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У ДРОЖЖЕЙ ЯАССНАКОМУСЕ СЬЖЕУШАЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные типы повреждений ДНК и пути их репарации. . .

1.2. Типы взаимодействий между мутациями радиочувствительности. Эпистатические

группы генов.

1.3. Эксцизионная репарация нуклеотидов Эпистатическая группа ДАШ

1.4. Пострепликативная репащщя Эпистатическая

группа А

1.5. Рекомбинационная репарация Эпистатическая

группа ИАЕ.
1.6. Эксцизионная репарация оснований
1.7. Коррекция ошибочно спаренных оснований
1.7.1. Роль коррекции ошибочно спаренных оснований. Универсальная система коррекции ошибочно спаренных оснований.
1.7.2. Прочие системы коррекции ошибочно
спаренных оснований. Н1М и НБМ гены.
1.7.3. Способы экспериментальной регистрации нарушения коррекции ошибочно спаренных оснований
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Список сокращенных названий веществ и
буферных растворов.
2.2. Основные штаммы и условия их культивирования.
2.2.1. Обозначения генотипов дрожжей
2.2.2. Штаммы.
2.2.3. Состав питательных сред и условия культивирования штаммов, использованных в работе.
2.3. Методы.
2.3.1. Осаждение ДНК этанолом.
2.3.2. Аналитический электрофорез с
выделением ДНК в лунках.
2.3.3. Выделение небольших количеств двуцепочечной плазмидной ДНК из . i кипячением.
2.3.4. Выделение больших количеств двуцепочечной плазмидной ДНК из . i методом щелочного
2.3.5. Выделение ДНК из дрожжей при переносе челночных плазмид в . i
2.3.6. Выделение одноцепочечной плазмидной ДНК
2.3.7. Наработка бактериофагапомощника МК
в больших количествах.
2.3.8. Секвенирование ДНК.
2.3.9. Трансформация . i
2.3 Трансформация . vii.
2.3 Микроманипулирование и тетрадный анализ.
2.3 Учет частоты спонтанных мутаций канаванинустойчивости.
2.3 УФоблучение суспензии клеток.
2.3 Учет выживаемости при УФоблучении
2.3 Учет частоты появления мутантов при УФоблучении культуры дрожжей.
2.3 Качественная оценка мутаторности по частоте прямых мутаций канаванинустойчивости
2.3 Качественная оценка чувствительности к
метил метансульфонату
2.3 Стандартные молекулярнобиологические и микробиологические методы.
2.3 Статистические методы обработки результатов
ГЛАВА 3. СОЗДАНИЕ СИСТЕМЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ И
НАПРАВЛЕНИЯ КОРРЕКЦИИ ОШИБОЧНО СПАРЕННЫХ ОСНОВАНИЙ.
3.1. Конструирование плазмид с однонуклеотидными заменами в гене А1Е
3.2. Конструирование плазмид, содержащих ошибочно спаренные основания
ГЛАВА 4. КАРТИРОВАНИЕ ГЕНА ШМ
4.1. Хромосомная локализация гена НБМ
4.2. Картирование гена ШМ2 относительно
маркеров правого плеча хромосомы IV.
ГЛАВА 5. СВОЙСТВА МУТАЦИИ ът
5.1. Влияние мутации Ьзт2 на коррекцию искусственных
гетеродуплексов и спонтанный мутагенез
5.1.1. Эффективность и преимущественное направление коррекции использованных в работе искусственных гетеродуплексов в
штамме дикого типа.
5.1.2. Влияние мутации 5т2 на эффективность
коррекции искусственных гетеродуилексов
5.1.3. Влияние мутации 2 на преимущественное направление коррекции искусственных гстеродуплсксов
5.1.4. Взаимодействие мутаций i2 и мутации
при коррекции ошибочно спаренных оснований.
5.1.5. Влияние мутации 2 на спонтанный мутагенез. Взаимодействие мутаций 2 и мутации при спонтанном мутагенезе
5.2. Взаимодействие мутации 2 с мутациями в генах других систем репарации ДНК при УФоблучении и при обработке метилметансульфонатом
5.2.1. Влияние мутации 2 на чувствительность к УФоблучению и ММС и на и УФиндуцированный мутагенез
5.2.2. Взаимодействие мутаций 2 и
5.2.3. Взаимодействие мутаций 2 и v3.
5.2.4. Взаимодействие мутаций 2 и
5.2.5. Взаимодействие мутаций 2 и .
5.2.6. Взаимодействие мутации i2 и
ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6.1. Система оценки эффективности и направления
коррекции ошибочно спаренных оснований
6.2. Новые аспект коррекции ошибочно спаренных оснований у . vii.
6.3. Влияние мутации 2 на коррекцию ошибочно спаренных оснований в плазмидах. Роль продукта гена 2 в коррекции ошибочно спаренных оснований.
6.4. Участие продуют гена 2 в репарации прсдмутационных повреждений, возникающих в результате работы склонной к ошибкам репарации. .
6.5. Гипотетическая схема механизма репарации
предмутационных повреждений, возникающих при обходе некодирующих повреждений ДНК с участием продукта гена
6.6. Участие продукта гена 1 в репарации предмутационных повреждений при УФоблучении
6.7. Совместное участие продуктов генов 2 и II
в репарации предмутационных повреждений.
6.8. Репарация предмутационных повреждений с участием продукта гена 2 как новый пример участия КОСО в процессах рекомбинации
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Системы репарации ДНК, являясь механизмами, обеспечивающими поддержание стабильности генетического материала, играют важную роль как в жизнедеятельности отдельных клеток и организмов, 1ак и в эволюции в целом. Знание принципов функционирования этих систем, их взаимодействия друг с другом и другими системами клетки необходимо для понимания таких фундаментальных явлений, как наследственность, изменчивость и мутагенез. Исследование механизмов репарации ДНК является одним из наиболее активно развивающихся направлений современной генетики.
Актуальность


Таким образом, было доказано участие продукта гена 2 в никзависимом процессе коррекции ошибочно спаренных оснований. Результаты этого исследования свидетельствуют об участии продукта гена ШМ2 в репарации предмутационных повреждений, возникающих в ходе работы пострепликативной репарации ДНК. На основании полученных результатов рассматривается роль продукта гена НБМ2 в контроле уровня спонтанного и индуцированного мутагенеза. Работа выполнена в Лаборатории генетики эукариот Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б. П. Константинова Российской Академии Наук. ГЛАВА 1. СИСТЕМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У ДРОЖЖЕЙ vii. Обзор литературы. Основные типы повреждений ДНК и пути их репарации. Геномная ДНК представляет собой крупную биомолекулу, которая должна сохраняться в течение всего срока существования клетки. Вместе с тем, молекула ДНК обладает ограниченной стабильностью, и в ней постоянно возникают повреждения различного рода, вызванные как процессами нормального метаболизма клетки, так и различными воздействиями внешней среды. Возникновение таких нарушений структуры ДНК может приводить к гибели клетки иили появлению мутаций. УФ двуцепочечные разрывы ДЦР возникают под действием ионизирующего излучения. УФ или ионизирующем облучении. Пиримидиновые димеры, сшивки и ДЦР относятся к повреждениям ДНК, предпочтительно инактивирующим клетку, но могут иметь и мутагенный эффект i, Сох, , . Потери оснований ДНК могут происходить в клетке спонтанно, гак как гликозильная связь между основанием и дезоксирибозой обладает заметной лабильностью. При этом образуются апуриновые апиримидиновые сайты АПсайты. К возникновению АПсайтов приводит также действие специфических ферментов, ДНК гликозилаз см. АПсайты могут иметь как мутагенный, так и цитотоксический эффект , , . Модификации оснований происходят как спонтанно, так и под воздействием разнообразных химических агентов. В процессе дезаминирования аминогруппа основания ДНК заменяется кетогруппой. Хорошо изученным дезаминирующим агентом является азотистая кислота Наиболее важным процессом дезаминирования является потеря цитозином аминогруппы с образованием урацила. Другие реакции дезаминирования включают превращение аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин, 5мстилцитозина в тимин. Окисление оснований происходит под действием свободных радикалов, которые могут возникать в ходе клеточного метаболизма и под действием ионизирующей радиации. К ал копированию оснований приводит воздействие как экзогенных химических веществ например, метилмстансульфоната ММС, так и эндоген нот аденозилметионина, биологического донора метильных групп. Ошибочно спаренные основания и микропетли ДНК возникают в процессе репликации. Большинство из них сразу же исправляется корректирующей субъединицей ДНКполимеразы 5, но часть их сохраняется в ДНК. Такие повреждения являются предмутационными , . В ходе эволюции в клетках возникли разнообразные системы репарации повреждений ДНК. В удалении из ДНК пиримидиновых димеров участвуют процессы фотореактивации и эксцизионной репарации нуклеотидов. Обход некодирующих повреждений при репликации осуществляется в ходе так называемой пострспликативной репарации. Рекомбинационная репарация осуществляет, в основном, репарацию двуцепочечных разрывов ДНК см. Удаление из ДНК модифицированных оснований и АПсайтов осуществляется в ходе процесса эксцизионной репарации оснований , , i, ii, . Ошибочно спаренные основания и микропетли ДНК репарируются системами коррекции ошибочно спаренных оснований иначе, мисматчкоррекция, i i см. Продукт гена 2, изучению которого посвящена эта работа, участвует в системе поддержания стабильности генетического материала, которая не может быть идентифицирована как одна из известных в настоящее время систем репарации. В связи с этим, целесообразно подробнее рассмотреть перечисленные выше известные механизмы репарации ДНК, чтобы впоследствии, при обсуждении результатов, определить место системы, в которой участвует продукт гена 2, среди прочих систем репарации ДНК.