Получение и анализ соматических гибридов между опухолевыми (трансформированными) и нормальными клетками высших растений

• Автор: Каневский, Иван Федорович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1987
• Место защиты: Киев
• Количество страниц: 178 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
Введение .

Обзор литературы

. I. Соматическая гибридизация высших растений .

1.1. Методы конструирования растительной клетки

1.2. Мутанты клеток растений .

, 1.3. Приемы селекции соматических гибридов

1.4. Трансмиссионная генетика процесса парасексу

альной гибридизации близкородственных видов

1.4.1. Судьба ядерных генов при гибридизации со

матических клеток растений .

1.4.2. Двуродительское наследование и митотическая сегрегация плазмагенов при соматической гибридизации .
1.5. Трансмиссионная генетика процесса отдаленной
гибридизации
2. К. плазмиды АегоЪаегз.ит ЬитеГас1епб как
векторы ДЛЯ генетической инженерии ВЫСШИХ растений .
2.1. Гены вирулентности плазмиды К. А.ЬитеГас1епв
2.2. Структура и функции ТДНК
2.3. Перенос чужеродных генов в растительную клетку
Материалы и методы .
Глава I. Получение и анализ гибридов соматических клеток
ШссИапа р1итЪаеп1Гоа ЫаЪасит трансформированная гЪгiш итеГас1епз клеточная линия .
1.1. Гибридизация и выделение продуктов СЛИЯНИЯ
1.2. Анализ клеточных линий
1.3. Анализ клонов, полученных из единичных
гетерокариоцитов .
Глава 2. Получение и анализ межтрибных гибридов соматических клеток ii опухолевый штамм. V
2.1. Слияние протопластов и отбор гибридов
табак красавка .
2.2. Индукция морфогенеза у клеточных линий .
2.3. Биохимический анализ гибридных линий табак красавка
2.3.1. Судьба ядервых генных детерминант.
2.3.2. Судьба внеядерннх генных детерминант
2.4. Цитогенетический анализ гибридных клеток
Глава 3. Изучение признаков, связанных с экспрессией
генов Трайона у соматических гибридов ii
3.1. Активность лизопиндегидрогеназы
3.2. Супрессия стеблевого органогенеза
3.3. Супрессия ризогенеза .
3.4. Способность к гормононезависимому росту и
росту на лактозе
3.5. Устойчивость к 2аминоэтилцистеину АЭЦ
3.6. Устойчивость к 5бровдезоксиуридину БрДУ
3.7. Устойчивость к 5метилтридтофану МТ
Глава 4. Отдаленная гибридизация
4.1. Выделение и анализ межсемейственных гибридов клеток В комбинации ВИДОВ Vii
ii опуХОЛвВЫЙ ШТЭММ
4.2. Эксперименты по гибридизации опухолевых клеток табака с мезофильными клетками кукурузы
и ячменя .
Обсуждение полученных результатов .
Выводы
Литература


ПЭГ Као, i , i . 9,0 с высокой концентрацией 0 0 мГЛ ионов кальция i , , . В настоящее время наиболее популярной и эффективной является методика ПЭГ высокое содержание Са высокий Као , иногда в высокощелочной буфер добавляются диметилсульфоксид в концентрации ДОСО . Подавляющее большинство неполовых гибридов у растений получено при использовании именно этой техники Глеба, Сытник, . Несколько лет назад в лаборатории У. Циммермана разработан принципиально новый метод индукции слияния протопластов, при котором для агглютинации и слияния протопластов на клетки воздействуют электрическим полем. Переменное поле с высокой частотой около 5 кГц и малой амплитудой 5 В приводит к слипанию и выстраиванию протопластов в цепочку между электродами, а наложение дополнительного короткого импульса вызывает собственно слияние i , i , . Эффективность описанной методики высокая и ее также можно использовать для слияния протопластов различного тканевого и видового происхождения и получать соматические гибриды , i , . Недавно исследователями из ФРГ разработан метод, позволяющий сливать единичные протопласты в микрокаплях объемом нл с помощью электрического поля. В сочетании с предложенной этими же авторами техникой культивирования единичных клеток растений в микрокаплях питательной среды объемом в несколько десятков нанолитров помещаемых под минеральным маслом для предотвращения интенсивного испарения среды коор . Вопервых, исследователь может контролировать количество клеток, вступающих в слияние 2,3 и более , причем клетки могут быть любого происхождения из листа, каллуса, стебля и др. Таким образом, методика индивидуального слияния протопластов с помощью электрических импульсов в микрокаплях представляется наиболее перспективной и в будущем позволит проводить наиболее строго контролируемые генетические опыты с использованием гибридизации соматических растительных клеток. Для генетического конструирования не обязательно использовать целые клетки обоих родителей, можно сливать субпротопласты минипротопласты, нуклеопласты, цитопласты, что дает новые возможности в реконструкции наследственности клетки см. Зеленин и др. В лаборатории П. Малиги i . . iii с цитопластами стрептомицинустойчивого табака, выделенными по методике Х. Лрца с сотр. . В этих опытах авторам удалось получить 8 растений, клетки которых имели хромосомы ОТ . ДНК подтвердил наличие в клетках этих растений пластид стрептомицинустойчивого табака. Так, и в работе П. Малиги с сотрудниками нельзя исключить возможность возникновения описанных форм не вследствие слияния целой клетки с цитопластом, а как результат слияния протопласт протопласт с последующей сегрегацией ядра одного из партнеров поскольку в препарате выделенных цитопластов содержалось 27 интактных протопластов. Предпринимались также попытки индукции поглощения изолированных клеточных органелл, в частности, хлоропластов протопластами, при этом использовали обработку протопластов модификаторами мембран лизоцим, нитрат натрия в сочетании с центрифугированием , , , , совместно агглютинацию органелл и протопластов с помощью лолиэтиленглиКОЛЯ , i, , . К сожалению , подтвердить генетически факт пересадки органелл с помощью описанных методик пока не удалось Глеба, , . , . Весьма заманчивой казалась перспектива пересадки в протопласты изолированных метафазных хромосом, что с успехом применяется в опытах с животными клетками см. Здесь наибольшие затруднения возникли в связи с необходимостью синхронизации культуры растительных клеток, что является предпосылкой выделения больших количеств изолированных метафазных хромосом. Применение различных способов воздействия на те или иные стадии синтеза ДНК ПОЗВОЛИЛО некоторым авторам i, , i, . i .