Функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена К-ras мыши, связанных с развитием рака легких

• Автор: Антонцева, Елена Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 108 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Семейство протоонкогенов

2.1.1. Функциональная значимость белков семейства

2.1.2. Структура белков

2.1.3. Ген и канцерогенез лгких

2.2. Единичные нуклеотидные замены

2.3. Транскрипционные факторы

2.3.1. Транскрипционный фактор

2.3.2. Транскрипционный фактор

3. Материалы и методы
3.1. Материалы, использованные в работе
3.2. Олигонуклеотиды
3.3. Животные
3.4. Выделение геномной ДНК из лгких мыши
3.5. Получение препаратов ДНК с использованием
полимеразной цепной реакции ПЦР
3.6. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля
3.7. Получение экстракта ядер лгких мышей
3.8. Введение метки в ДНК с помощью фрагмента Клнова
3.9. Введение кощевой метки в ДНК
3 Метод задержки ДНКзонда в ПААГ белками ядерного экстракта
3 Вестернблот анализ
3 Поиск сайтов гиперчувствительности К ДНКазе I
31. Обработка ядер клеток легкого ДНКазой I
32. Гибридизация по Саузерну
4. Результаты и обсуждение
4.1. Изучение связывания ядерных белков с районом локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена ККая мыши
4.2. Идентификация транскрипционных факторов, взаимодействующих с областью ого кодона гена КЛая мыши
4.3. Влияние легочных канцерогенов 3метилхолантрена
и нитрозоэтилмочевины на ДНКсвязывающую активность транскрипционных факторов ОЛТА6 И
5. Заключение
6. Выводы
7. Список цитированной литературы
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ЗМХ 3 метилхолантрена
НЭМ нитрозозтилмочсвины
ДНКаза I Дезоксирибонуклеаза I
мРНК информационная матричная РНК
а.о. аминокислотные остатки
п.и. пар нуклеотидов
ГТААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНКаза А рибонуклеаза А
ЕДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
кОа килодальтон
додецилсульфаг натрия
единичные нуклеотидные замены i i i
единичные нуклеотидные замены, модифицирующие кодоны структурной части генов i
единичные нуклеотидные замены, модифицирующие сайты сплайсинга ii
единичные нуклеотидные замены, модифицирующие характер г енной экспрессии
ацетилтрансфераза гистонови i
деацетилаза гистонов i
тимидии киназа
ТВР ТАТАбокс связывающая субъединица базального транскрипционного фактора II x ii i
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В связи с этим изучение молекулярных механизмов, посредством которых в интроне могут оказывать влияние на фенотипические признаки, представляется весьма актуальным и перспективным направлением. Ген является одним из наиболее известных протоонкогенов, мутации в котором как спонтанные, так и индуцированные химическими канцерогенами локализованы почти исключительно в трех горячих точках кодонах , и i . В настоящее время подобную направленность мутагенеза связывают, главным образом, с особенностями локальной структуры ДНК в местах предпочтительного возникновения мутаций , , . , . Однако такое объяснение является далеко не всеобъемлющим. Например, при анализе мутаций, затрагивающих кодоны , и гена , в опухолях легких у гибридных мышей, полученных скрещиванием чувствительных и резистентных линий, было показано, что мутация происходит только в чувствительном аллеле этого гена, несмотря на полную идентичность нуклеотидной последовательности обоих аллелей в местах образования мутаций . Известен также феномен тканевой специфичности напрашюнного мутагенеза. , а в легких в м кодоне гена i, . Такие закономерности дают основание думать об участии еще какихто механизмов в обеспечении избирательности мутационного процесса. В частности, поскольку для гена установлено, что чувствительность мышей разных линий к развитию рака легких коррелирует с в его втором интроне, можно предполагать, что эти нуклеотидные замены могут приводить к специфическим, характерным только для чувствительного аллеля изменениям в структуре хроматина иили конформации ДНК в районе го и го кодонов экзон 1, что может способствать образованию аддуктов ДНКканцероген и в последующем мутаций именно в этих позициях. Так как известно, что в формировании иили поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК, можно думать, что сопряженные с чувствительностью к пульмоноканцерогенезу затрагивают сайты связывания таких белков. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов, посредством которых единичные нуклеотидные замены во втором интроне гена могут влиять на формирование чувствительности к спонтанному и индуцированному раку легких у мышей, а также выяснение механизма высокой избирательности возникновения мутаций в м кодоне протоонкогена . Изучение влияния сопряженных с развитием рака легких мононуклеотдных замен в позициях 8 и 6 п. у М. Идентификация транскрипционных факторов, взаимодействующих с полиморфным районом. Изучение влияния замены в позиции 1 п. , отличающей мышей устойчивого к пулъмоноканцерогенезу вида М от чувствительных линий М. , на связывание с транскрипционными факторами и их идентификация. Изучение влияния различных вариантов на картину связывания ядерных белков с потенциальным композиционным элементом в начале интрона 2 гена , охватывающим область расположения всех трех сопряженных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен. Идентификация белков экстракта ядер клеток легких, взаимодействующих с областью первого кодирующего экзона гена мыши, включающей кодоны и , которые являются горячими точками возникновения мутаций в гене . После того как нами были получены данные о том, что с областью локализации кодонов и гена мыши и с районом расположения связанных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен взаимодействуют транскрипционные факторы и 6, была поставлена также задача определения влияния пульмоноканцерогенов на активность этих факторов. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что сопряженные с предрасположенностью к развитию рака легких у мышей во втором интроне гена являются потенциально регуляторными. Установлено, что СА вариант полиморфизма в позициях 8 и 6 п. ., соответствует комплексному сайту связывания транскрипционных факторов и АТА6, а в случае устойчивого и промежуточного СС вариантов этот сайт оказывается разрушенным. Показано также, что в результате замены СТ в позиции 1 п.