Клонирование и экспрессия химически синтезированного гена гормона брадикинина в клетках E. Coli.

• Автор: Капелинская, Т.В.
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 c. : ил

Все известные к настоящему времени векторные плазмиды представляют собой либо существующие в природе плазмиды, либо сконструированные i vi3 фрагментов различных природных плазмид. Первой плазмидой, использованной в качестве вектора, была плазмида II i,I3, , , . Она была получена при изучении двух факторов 6 и . Плазмида 6 несет устойчивость к тетрациклину Тсг, хлорамфениколу Сшг, канамицину Кш7, стрептомицину и сульфаниламидам . Она имеет также оперон, определяющий способность этой плазмиды переносить генетический материал при конъюгации клеток, т. Мц. Для конструирования плазмиды II препараты плазмидной ДНК 6 были подвергнуты механическому разрушению и смесь фрагментов была использована для траноформэ ции клеток е. Мнеоущая устойчивость к одному антибиотику тетрациклину и потерявшая свойство трансмиссибельности. Плазмида II имеет один участок узнавания Е I, не затрагивающий ген Тсг. Б дальнейшем была сконструирована серия векторных плазмид на основании плазмиды I. Плазмида I имеет ряд преимуществ перед II. Репликация этой плазмиды находится, в отли
получены путем механического разрушения молекул ДНК или при расщеплении специфическими эндонуклеазами рестрикции. Клонирование этих фрагментов ДНК называется шотган экспериментом, а популяция плагмид, содержащих все фрагменты тотальной ДНК, называется банком ИЛИ библиотекой генов , , , . Этими авторами дано уравнение, описывающее, какое количество трансформантов необходимо получить, чтобы в них вошла любая уникальная последовательность данного организма Р п и . I , где Р вероятность того, что данный ген присутствует в коллекции из трансформантов , а часть генома, которую представляет каждый фрагмент, х длина последовательности, которая должна быть неповреддена, I длина клонируемых фрагментов. Уравнение предполагает гомогенное распределение размера фрагментов при механическом разрушении, каждый трансформант является гибридным, а каждая гибридная молекула трансформируется с одинаковой эффективностью. Принимая р 0,, I , х I , то п для генов . З.Ю клонов. Из приведенных расчетов видно, что для сложных организмов эукариот такие эксперименты следует проводить о предварительно обогащенными фракциями ДНК. Однако клонирование уни
кальных последовательностей генов всших эукариот представляет большие трудноститехники клонирования в векторных плазмидах недостаточно даже для обогащенных последовательностей, поэтому обычно для клонирования генов эукариот применяют фаговые векторы, обладающие большей емкостью при включении чужеродной ДНК I7, i , I9, , , i , , i , . Л под слабым контролем хозяина. Количество копий на клетку составляет молекулы, а при амплификации хлорамфениколом молекул на клетку. Молекулярный вес Ж равен 4,2 i , , , i, . Присутствие плазмиды в клеткахЕ. И устанавливается по способности клеток синтезировать колицин I и по иммунности к нему. Включение чужеродной ДНК по месту, расщепляемому i, приводит к инактивации гена синтеза колицина, но не затрагивает области иммунитета К нему I, , I, ,
Путем транслокации ампициллинового транспозона ТпА , из плазмиды I в плазмиду I была получена плазмида , несущая детерминанту устойчивости к Ампициллину iI5. В последующем были созданы плазмидные векторы, несущие по две и даже по три детерминанты устойчивости к антибиотикам. На таблице I представлены плазмидные векторы, использующиеся при клонировании генов. Все они имеют ряд преимуществ и недостатков друг перед другом. Более подробное описание конструирования векторных плазмид дано в опубликованных обзорах i , . В настоящее время наиболее широко используется плазмида 2 iv а1Д7. Эта плазмида была сконструирована при изучении плазмиды ЕУ, содержащей гены, системы рестрикциимодификации . I. На первом этапе была получена плазмида I i , . После транслокации в нее транспозона ТпА из плазмиды была получена плазмида рМВЗ. Серией последующих модификаций и одновременной трансформацией I фрагментов плазмиды рМВ8 и Е I фрагментов II была получена плазмида рМВ9, несущая устойчивость к тетрациклину. I,i . Мини I 2,1 i I i

5I ,. I. ,. I I,I, ,. I,I. VII,V. I ,.