Генетический контроль метаболизма 6-гидроксиламинопурина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерий Escherichia coli

• Автор: Козьмин, Станислав Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 140 с. : ил.

1 аденилосукцинатлиаза

АСС аденилосукцинатсинтетаза

АФРТ аденинфосфорибозилтрансфсраза

ГА гидроксиламин

ГАГ гуанинаминогидролаза

Г АП 6гидроксиламиноиурин

ГАПРиб 6гидроксиламинопуринрибозид

ГАПРибМФ 6гидроксиламинонуринрибонуклеозидмонофосфат

ГАГГдРибТФ 6гидроксиламинопуриндезоксирибонуклеозидтрифосфат

ГАР 5фосфорибозилглицинамид

ГГФРТ гуанингипоксантинфосфорибозилтрансфераза

ГИК гуанозининозинкиназа
Гип гипоксантин
ГипФРТ гипоксантинфосфорибозилтрансфераза
ГМК ГМФкиназа
ГМР ГМФредуктаза
ГМС ГМФсинтетаза
Гуа гуанин
ГуаРиб гуанозин
Г ФРТ гуанинфосфорибозилтрансфераза
ГЦ 4гидроксиламиноцитидин
ДМСО диметилсульфоксид
ДСН додецилсульфат натрия
ДТТ дитиотреитол
ИДГ ИМФдсгидрогеназа
ИМФ инозинмонофосфат
Ино инозин
КАИР 5фосфорибозил5аминоимидазол4карбоксилат Кин киназа
КМФ ксантозинмонофосфат
ксантин
МГД молибдогттерингуаниндинуклеотид
МД среда минимальная с декстрозой
МДБА среда минимальная с дексчрозой без азота
НАД никотинамидадениндинуклеотид
НАДФ никотинамидадениндинуклеотидфосфат
НДК нуклеозиддифосфаткиназа
Нук 5Нук 5нуклеотидаза
НФ нуклеозидфосфорилаза
ОРС открытая рамка считывания
ПЕП среда с пептоном без фосфата
ПЕПФО среда с пептоном с фосфатом
ПИФ пуриновая нуклеозидфосфорилаза
ПЦР полимеразная цепная реакция
РДР рибонуклеозиддифосфатредуктаза
РТР рибонуклеозидчрифосфатредуктаза
РФ рибозо5фосфат
САИКАР 5фосфорибозил4Лгсукцинокарбоксамид5амииоимидазол САМФ сукцинилАМФ
СПИД синдром приобретенного иммунодефицита
ТМАО триметиламинИоксид
Трис 2амино2гидроксиметил1,3пропандиол
ТСХ тонкослойная хроматография
УФ ультрафиолетовый.
ФАД флавинадениндинуклеотид
ФАИКАР 5фосфорибозил4карбоксамид5формамидоимидазол
ФГАМ 5фосфорибозилАформилглицинамидии
ФГАР 5фосфорибозилАформилглицинамид
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ФРА 5фосфор0рибозиламин
ФРПФ 5фосфоос0рибозил1пирофосфат
ХП 6хлорпурин
ЭДТА этилендиаминтечраэтановая кислота
устойчивость к адипату
устойчивость к канаванину
устойчивость к хлорату в анаэробных условиях
чувствительность к хлорату в анаэробных условиях
чувствительность к Г АП, свойственная дикому типу
сверхчувствительность к ГАП
Кап устойчивость к канамицину полная среда i
полная среда i
i устойчивость к рифампицину устойчивость к тетрациклину V минимальная среда V
, полные среды
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ


Результаты проведенных генетических экспериментов позволили нам заключить, что усвоение дрожжевой клеткой замещенных в шестом положении аналогов аденина происходит через превращение аналогов в инозинмонофосфат основными способами утилизации ГАП являются дезаминирование аналога до гипоксантина аденинаминогидролазой и фосфорибозилирование аденинфосфорибозилтрансферазой и, вероятно, гуанингиноксантинфосфорибозилтрансферазой. Показано, что полная инактивация дрожжевого гена НАМ1 не влияет на спонтанную мутабильность в стандартных условиях культивирования и слабо повышает мутабильность в условиях глюкозной индукции цитохрома Р0. Мутация не влияет на способность клетки дезаминировать ГАП в гипоксантин. ГАПредуктазу, кагализирующую превращение ГАПрибонуклеотида в адениловый рибонуклеотид. Мы установили сходство метаболических функций и гомологичного белка . Установлено, что причина сверхчувствительности к ГАН бактериальных штаммов с дслецией vi заключается в нарушении биосинтеза молибдоптерина кофактора оксидоредуктаз. Мы полагаем перспективным применение ГАП для исследования метаболизма пуринов i viv, поскольку уровень индуцированного ГАП мутагенеза чувствительный индикатор состояния ферментов системы взаимопревращенияутилизации пуринов. Полученные нами данные о строгой специфичности к ГАП белков и могут интерпретироваться как подтверждение данных литературы о возможности образования ГАП i viv, в связи с чем результаты нашего исследования могут быть важны для понимания молекулярных механизмов мутагенеза и канцерогенеза. Результаты, свидетельствующие о существенной роли молибденового кофактора для детоксификации широкого круга аналогов, необходимо учитывать при проверке мутагенной активности соединений в тесте Эймса, поскольку все используемые в тесте штаммы имеют дефект в биосинтезе этого кофактора. Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Аналог 6гидроксиламинопурин. Биологическая активность 6гидроксиламинопурина. Впервые химический синтез ГАП см. Было показано, что ГАП является сильным мутагеном для фага Т4 , , бактерий . Павлов и ХромовБорисов, vv , , грибов . ХромовБорисов, , , , ii i vv v, , i ii Попова и др. ГАП не индуцирует митотическую рекомбинацию у дрожжейсахаромицетов Павлов и ХромовБорисов, Павлов и др. ГАГ1 в основном обусловлен индукцией мутаций в жизненно важных генах Павлов и др. Рисунок 1. Амбивалентное спаривание ГАП в ДНК i , . Мутагенные свойства ГЛП проявляются только при обработке активно делящейся культуры, что рассматривают как свидетельство репликативного механизма ндуцированного ГАП мутагенеза Павлов и ХромовБорисов, vv , . Мутагенный эффект ГАП у большинства объектов значительно превосходит эффект классических аналогов, 2аминопурина и 5бромурацила, на основании чего ГАП условно относят к группе аналоговсупермутагенов, включающей также 2амино6гидроксиламинопурин АГАП и 4Vгидрокси и 4Vноцитидин. При секвснировании мутаций, индуцированных ГАП у дрожжей . Павлов и Тарунина, v vv, и бактерий . ГАП вызывает преимущественно замены пар оснований транзиции ТА или ТА. Высокоэффективная индукция транзиций указанного типа была продемонстрирована в оригинальной системе олигонуклсотидной трансформации дрожжейсахаромицетов, позволяющей замещать локальный участок ДНК на гомологичный олигонуклеотид, содержащий ГАП в заданной позиции v, . В экспериментах ш vi показано, что как прокариотические, гак и эукариотические ДНКполимеразы способны встраивать ГАПдезоксирибонуклеозидтрифосфат в ДНК как вместо дАТФ, так и вместо дГТФ, что согласуется с наблюдаемой i viv мутагенной специфичнностыо i , . Предполагают, что мутагенный эффект ГАП определяется его способностью к амбивалентному спариванию в ДНК, что связано с таутомерными переходами 6гидроксиламиновой группы рис. Если преобладающей формой аденина является аминоконфигурация, то для ГАП показаны соотношения аминоимино форм от в ДМСО до в метаноле см. ГАП и в физиологических условиях. Таким образом, ГАП в аминоформе образует в ДНК пары с тимином, а в иминоформе с цитозином рис.