Получение генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum L.), экспрессирующих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы

• Автор: Титов, Сергей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Роль пролина в системе стрессоустойчивости растений.

1.1.1. Стресс у растений

1.1.2. Сигнальные пути в клетках растений при стрессе.

1.1.3. Роль пролипа при стрессе

1.1.4. Регуляция уровня пролина в клетке.

1.2. Создание стрессоустойчивых форм растений с использованием методов генной инженерии.
1.2.1. Грансгенные растения, экспрессирующие регуляторы стрессорного ответа
1.2.2. Трансгенные растения, нарабатывающие белки стрессорного ответа
1.2.3. Трансгенные растения, 1арабатывающие белкирегуляторы ионного баланса.
1.2.4. Трансгенные растения с повышенным содержанием пролина и других осморегуляторов
1.2.5. Перспективы создания стрессоустойчивых форм растений
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Растительный материал.
2.1.2. Бактериальные штаммы
2.1.3. Плазмиды
2.1.4. Реактивы
2.1.5. Ферменты
2.1.6. Праймеры
2.1.7. Среды и буферные растворы.
2.2. Методы
2.2.1. Генноинженерные работы
2.2.2. Получение трансгенных растешй табака.
2.2.3. Молекеляргюгенетический анализ трансформантов
2.2.4. Определение свободного пролина в растительном материале.
2.2.5. Определение содержания малонилдиальдегида в листьях трансгенных растений
2.2.6. Определение осмотического давления в клетках эпидермиса листьев.
2.2.7. Определение активности пролиндегидрогеназы
2.2.8. Компьютерная обработка данных.
2.2.д. Статистичеате методы исследования.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Получение антисмыслового супрессора ПДГ рВЕ.
3.2. Получение растенийтрансформантов табака
3.3. Доказательство присутствия трансгенных встроек в геномах полученных растений
3.4. Измерение содержания пролина в листьях трансгенных растений.
3.5. Измерение активности фермента пролиндегидрогеназы в листьях трансгенных растений.
3.6. Измерение содержания малони л диальдегида в листьях трансгенных растений.
3.7. Измерение осмотического давления клеточного сока и осмотического потенциала клеточного сока в листьях трансгенных растений.
3.8. Изучение солеустойчивости трансгенных растений
3.9. Получение двуцепочечного супрессора ПДГ рВЕ.
3 Измерение содержания пролина в листьях трансгенных растений, несущих двуцспочечиый супрессор
3 Получение антисмыслового супрессора ПДГ, содержащего полный первый экзон рВЕБ
3 Получение минимальной конструкции на основе антисмыслового супрессора ПДГ с полным первым экзоном рВЕРппп.
3 Прямая селекция трансформантов на стрессовом фоне
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Система деградации пролина и ее роль в стрессоустойчивости инфрмация на момент начала исследований
4.2. Растения, несущие гетерологичный антисмысловой супрессор гена ПДГ, характеризуются пониженной активностью пролиндегидрогензы и увеличенной устойчивостью к засолению
4.3. Минимальная генетическая конструкция как инструмент отбора растений на стрессовых фонах.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
Список цитируемой литературы


Получена новая информация о роли ПДГ в контроле стрессоустойчивости растений показано, что частичная супрессия гена ПДГ сопровождается повышением устойчивости растений к засолению, что позволяет выдвинуть гипотезу о возможности контроля стрессоустойчивости за счет изменения активности этого фермента. Предложен новый подход для получения стрессоустойчивых форм растений, основанный на использовании теистических конструкций супрессоров ГДГ. Практическая ценность. Создан набор генетических конструкций, которые могут быть использованы для получения стрессоустойчивых форм растений. Показана возможность создания достаточно эффективного супрессора на основе гетерологичного гена. Разработан подход, позволяющий исключать из состава генетических конструкций маркерные гены устойчивости к антибиотикам и проводить отбор трансформантов непосредственно на стрессовых фонах. Подана заявка на патент Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина. Генетические конструкции, содержащие супрессоры гена пролиндегидрогеиазы, переданы и используются в Институте физиологии растений РАН и ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН. Положении, выносимые на защиту. Создан антисмысловой супрессор гена ПДГ. Показано, что частичная супрессия гена ПДГ увеличиваег стреесоустойчивость растений, что подтверждает гипотезу о роли этого гена в контроле стрессоустойчивости. Созданы генетические конструкции, не содержащие генов устойчивости к антибиотикам и несущие миннмапьиос количество чужеродной для растения векторной ДИК. Показана возможность отбора и получения траисгснных растений, несущих антисмысловой супрессор ПДГ, на средах, не содержащих антибиотики. Апробации работы. МОГиС, Международной конференции биология растительных клеток ш уИго и биотехнология, Саратов, Съезде ВОГиС, Москва, III международной научной конференции Факторы экспериментальной эволюции организмов, Украина, Алушта, Всероссийской конференции Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды, Иркутск, . Публикации. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 8 страницах, включает рисунок и фотографии, 2 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиотрафичсскнй указатель включает 6 источников. В природных условиях растения очень часто подвергаются воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Способность растений приспосабливаться к экстремальным условиям произрастания и сохранять при этом свой жизненный потенциал является одним из определяющих условий существования растений. В зависимости от характера воздействия запускаются неспецифические механизмы защиты или специфические реакции адаптации к изменившимся условиям Полевой, . Реакция растения на абиотический стресс развивается на разных уровнях биохимическом, физиологическом, морфологическом, II основным результатом всех защитных и адаптивных изменений является поддержание функций важнейших биохимических процессов фотосинтеза, дыхания. В целом, на растение может действовать сразу несколько неблагоприятных факторов. В любом случае на начальном этапе адаптации стрессреакция запускаются неспецифические защитные механизмы, основная функция которых не допустить повреждения важнейших биохимических систем клегки Кузнецов и Шевякова, . Результат действия неспецнфичсских механизмов защита мембран, защита важнейших макромолекул ДНК, фотосистем 1 и II, элементов цепи переноса электронов и нейтрализация свободных радикалов, образующихся при многих видах стрсссорного воздействия. Также необходимо удержание осмотического давления и внугри клеток в определенных пределах. Известно, что в условиях абиотического стресса высокие и низкие температуры, водный дефицит, засоление в клетках растений повышается концентрация совместимых осмолитов низкомолекулярных осмотически активных органических соединений, не оказывающих токсического действия I , . К ним относятся маннитол, фруктаны, глнцинбетанн, пролин. Самым распространенным и изученным из совместимых осмолитов является пролин.