Трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены гетерологичных секреторных нуклеаз, как модель для изучения вирусоустойчивости

• Автор: Трифонова, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 111 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Неспецифические системы устойчивости высших растений к

вирусным патогенам.

1.1.1. Системная приобретенная устойчивость.

1.1.2. Использование генов РЯбслков в генетической инженерии.

1.1.3. Системная устойчивость, индуцируемая непатогенными почвенными бактериями.

1.1.4. Устойчивость, индуцируемая насекомымнфитофагами.

1.2. Специфические системы защиты растений от вирусных патогенов.

1.2.1. Перекрестная защита.
1.2.2. Использование механизмов перекрестной защиты для создания вирусоустойчивых растений путем трансгенсза трансгенные растения, экспрессирующие гены капсидных белков вирусов.
1.2.3. Индуцируемый вирусами генетический сайленсинг.
1.2.4. Использование механизмов генетического сайленсинга для
создания вирусоустойчивых растений путем трансгенеза.
1.3. Использование неструктурных генов вирусного происхождения для
создания вирусоустойчивых растений путем трансгенеза.
1.4. Другие подходы создания вирусоустойчивых растений путем
трансгенеза.
1.4.1. Трансгенные растения, экспрессирующие Ыгены табака.
1.4.2. Трансгенные растения, экспрессирующие гены а и ринтерферона человека и олигоаденилатную противовирусную систему млекопитающих.
1.4.3. Трансгенные растения, экспрессирующие антитела.
1.4.4. Трансгенные растения, экспрессирующие гены белков, инактивирующих рибосомы.
1.4.5. Трансгенные растения, экспрессирующие гены рибозимов.
1.5. Роль нуклеаз в физиологических процессах высших растений.
1.5.1. Роль нуклеаз в генерации индуцируемой устойчивости
растений к патогенам.
1.5.2. Трансгенные растения, экспрессирующие гены нуклеаз.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.2.Мстоды.
2.2.1. Конструирование и анализ векторов.
2.2.2. Приготовление и трансформация компетентных клеток .i.
2.2.3. Выделение и анализ плазмидной ДК.
2.2.4. Полимеразная цепная реакция.
2.2.5. Приготовление и прямая трансформация компетентных клеток i i.
2.2.6. Получение трансгенных растений табака и картофеля.
2.2.7. Определение активности неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях.
2.2.8. Выделение и анализ геномной ДНК растений методом блотгибридизации.
2.2.9. Определение нуклсазной активности грубых экстрактов растений табака и картофеля.
2.2 Анализ спектра белков с нуклеазной активностью в экстрактах трансгенных и контрольных растений в полиакриламидном
геле с добавлением РНК в матрикс разделяющего геля.
2.2 Линии вирусов и инфицирование растений.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Создание модельных конструкций, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз.
3.1.1. Клонирование гена нуклеазы i .
3.1.2. Клонирование гена панкреатической рибонуклеазы быка.
3.2. Получение трансгенных растений табака.
3.3. Анализ полученных трансформантов на экспрессию маркерного гена,
наличие полноразмерной вставки и инсерции в геномной ДНК.
3.4. Анализ полученных трансгенных растений табака на наличие
повышенного уровня нуклеазной активности.
3.5. Локализация панкреатической рибонуклеазы в тканях трансгенных растений табака и количественная оценка содержания трансгенного белка.
3.6. Получение трансгенных растений картофеля.
3.7. Анализ полученных трансформантов картофеля на экспрессию
маркерного гена и наличие инсерции в геномной ДНК.
3.8. Анализ полученных трансгенных растений картофеля на
наличие повышенного уровня нуклеазной активности.
3.9. Анализ спектра белков с нуклеазной активностью с помошью электрофореза в БРБполиакриламидном аейукугеле.
3 Анализ полученных трансгенных растений табака на устойчивость
к вирусу табачной мозаики ТМУ.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Целью настоящей работы является изучение влияния эксграклеточных нуклеаз на формирование устойчивости растений к вирусным патогенам с использованием трансгенных растений, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз. Создать генетические конструкции, несущие гены секреторных нуклеаз, позволяющие повышать уровень нуклеазной активности в трансгенных растениях. Получить трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены секреторных нуклеаз. Оценить уровень нуклеазной активности в полученных трансгенных растениях и ее локализацию. Определить степень вирусоустойчивости трансгенных растений табака с повышенной экстраклеточпой нуклеазной активностью. В результате проведенных исследований была создана модельная система для изучения механизмов неспецифической устойчивости растений к вирусам. Клонированы гены гетерологичных секреторных иуклеаз и с их использованием созданы векторы для экспрессии в растительных клетках. Впервые получены трансгенные растения, экспрессирующие гены панкреатической секреторной рибонуклеазы быка и секреторной нуклеазы i . Показано, что уровень нуклеазной активности в листьях и стеблях полученных трансгенных растений значительно повышен по сравнению с контролем. Исследовано влияние повышенной нуклеазной активности на устойчивость растений к вирусам. Впервые показано, что экстраклеточные нуклеазы непосредственно участвуют в формировании устойчивости растений к вирусным инфекциям, что вносит вклад в понимание молекулярных механизмов неспецифической устойчивости растений. Получены трансгенные растения картофеля хозяйственно ценных сортов с повышенным уровнем экстраклеточной нуклеазной активности. Предложена новая стратегия создания растений, устойчивых к широкому спектру вирусных, а возможно также грибковых и вироидных инфекций, с использованием методов генетической инженерии, основанная на противовирусном действии экстраклеточных нуклсаз. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях Молекулярная генетика, геномика и биотехнология Минск, г. Международной научнопрактической конференции Института картофелеводства НАН Беларуси Минск, г. Пущино, г, на конференции МОГИС Москва, , на Первом Международном Конгрессе Биотехнология состояние и перспективы развития Москва. Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей. Кочетов , Шакирова Н. В., Лукашева В. В, Комарова М. Л., Пилюгин М. В., Трифонова Е. А., Дейнеко Е. В., Ривкин М. И., Шумный В. К. Экспрессия модельных бицистронов в трансгенных растениях Докл. Акад. Наук. Т.9. Трифонова Е. А., Кочетов , Шумный В. К. Роль нуклеаз в физиологических процессах высших растений Успехи совр. Т. 0. Трифонова Е. А., Комарова М. Л., Сырник О. Л., Кочетов , Шумный В. К. Трансгенные растения табака ii I, экспрессирующие нуклеазу i Генетика. Т С. Кочетов , Титов С. Е., Колодяжная Я. С., Комарова М. Илинскии Ю. Ю., Трифонова Е. А., Шумный В. К. Повышение содержания пролипа и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы Генетика. ТС. Трифонова Е. А., Комарова МЛ, Леонова Н. С., Щербань А. Б., Кочетов , Малиновский В. И., Шумный В. К. Трансгенные растения картофеля . II Доклады . Т.4. С. . Трифонова Е. А., Кочетов , Комарова М. Л., Шумный В. К., Малиновский В. И., Саиоцкий М. В. Способ получения трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Заявка ог . Благодарности. В разные периоды работа финансировалась за счет следующих грантов поддержки ведущих научных школ 4, Министерства образования РФ ЗВ1. Со РАН , интеграционной программе РАН . Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю к. Кочетову и сотрудникам лаборатории генной инженерии растений к. М.Л. Комаровой, Романовой, С. Е. Титову и Я. С. Колодяжной сотрудникам БПИ ДВО РАН д. В.И. Малиновскому и к. М.В. Сапоцкому сотруднику лаборатории молекулярной генетики злаков А. Б. Щербато сотруднице селекционногенетической лаборатории Н. С. Леоновой, сотруднице сектора мутагенеза и репарации З. И. Панфиловой, участвовавших в ряде экспериментов или в обсуждении полученных результатов, отраженных в совместных публикациях.