Генетический контроль чувствительности про- и эукариотических микроорганизмов к мутагенным аналогам пуринов

• Автор: Степченкова, Елена Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Предшественники ДНК и их мутагенные аналоги

1.1.1. Метаболизм пуринов. Сравнительная характеристика метаболизма пуринов у . i и . vii

1.1.1.1.Биосинтез пуриновых нуклеотидов v

1.1.1.2.Утилизация и взаимопревращение пуринов.

1.1.2. Мутагенные аналоги пуринов. Механизм действия мутагенных предшественников ДНК.

1.1.3. 6гидроксиламинопурин.

1.2. Использование функциональной геномики для масштабного поиска генов, контролирующих чувствительность модельных микроорганизмов

. . i и . vii к различным мутагенам.

1.3 .Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе
2.1.1. Штаммы бактерий.
2.1.2. Штаммы дрожжей
2.1.3. Плазмиды
2.2. Среды и условия культивирования.
ф 2.3. Реактивы
2.4. Методы генетики микроорганизмов.
2.4.1. Бактерии
2.4.1.1. Стандартные генетические методы.
2.4.1.2. Качественный тест на токсичное и мутагенное действие аналогов.
2.4.1.3. Количественный тест на индукцию прямых мутаций в гене i.
2.4.1.4. Тестирование штаммов на чувствительность к хлорату калия
2.4.1.5. Создание геномной библиотеки инсерционных мутантов
. i
2.4.1.6. Анализ бактериальных геномных библиотек с целыо выявления
генов, контролирующих чувствительность к ГАП.
2.4.2. Дрожжи
2.4.2.1. Стандартные генетические методы.
2.4.2.2. Получение штаммов дрожжей
2.4.2.3. Тестирование мутагенной активности аналогов оснований
2.4.2.4. Тестирование чувствительности клеток дрожжей к токсичному действию ЭМС и УФсвета
2.4.2.5. Геномный скрининг с использованием дрожжевой библиотеки делеционных мутантов для поиска штаммов, чувствительных к ГАП
2.5. Молекулярногенетические методы.
2.5.1. Стандартные молекулярногенетические методы.
2.5.2. Идентификация места инсерции транспозона
iV2 в хромосоме . i.
2.6. Статистические методы.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Поиск генов, контролирующих чувствительность к ГАП у бактерий
. i
3.1.1. Создание и анализ случайных геномных библиотек инсерционных мутантов . i.
3.1.2. Результаты скрининга геномных библиотек случайных инсерционных мутантов у бактерий.
3.1.2.1. Гены, инактивация которых приводит к повышению чувствиельности клеток к ГАП.
3.1.2.2. Ген принадлежит МоКозависимому пути детоксикации ГАП
3.1.2.3. Ген контролирует новый МоКонезависимый путь
детоксиеации ГАП.
3.1.2.4. Анализ ауксотрофов
3.1.2.5. Гены, инактивация которых приводит к супрессии ГАП фенотипа
у мутантов усЬХ
3.2. Геномный скрининг с целью выявления генов, контролирующих чувствительность дрожжей . vii к ГАП.
3.2.1. Подбор условий для скрининга дрожжевой делеционной библиотеки.
3.2.2. Результаты скрининга дрожжевой библиотеки делеционных мутантов.
3.2.3. Проверка чувствительности ГАП , мутантов идентифицированных в геномном скрининге, к действию других мутагенов
3.3. Изучение влияния мутаций в генах i4, , 7 и 3 на чувствительность клеток дрожжей к ГАП
3.4. Идентификация генов, отвечающих за активацию ГАП у дрожжей ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Генетический контроль чувствительности . i к мутагенному и токсичному действию ГАП
4.2. Генетический контроль чувствительности дрожжей . vii к
мутагенному и токсичному действию ГАП.
4. 3. Сравнение генетического контроля ГАПиндуцированного
мутагенеза у бактерий . i и дрожжей . vii.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Общей чертой у исследованных микроорганизмов является способность ГАП включаться в клеточный метаболизм ферментами утилизации пуринов и участвовать в реакциях, характерных для аденииа. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, имеют значение для более полного понимания механизмов мутагенеза и канцерогенеза. Данные, представленные в работе, могут быть полезны при создании новых тестсистем для выявления факторов, нарушающих пул предшественников ДНК и являющихся источником спонтанных и индуцированных мутаций. У человека известны наследственные заболевания, вызванные мутациями в генах, гомологичных некоторым из идентифицированных нами в этой работе. Штаммы бактерий и дрожжей, несущие мутации соответствующих генов, могли бы стать моделями для изучения этих заболеваний. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Предшественники ДНК и их мутагенные аналоги. Точность и эффективность синтеза ДНК во многом зависит от количественного и качественного состава предшественников ДНК дезоксирибонуклеозидтрифосфатов дНТФ аденина, гуанина, тимина и цитозина. В клетке . ДНК в любой момент времени не превышает 1 от количества, необходимого для репликации всей геномной ДНК. В клетках млекопитающих пул дНТФ еще ниже табл. Поэтому синтез предшественников ДНК происходит постоянно. Таблица 1. Содержание нуклеотидов в клетках . I . Такие побочные продукты метаболизма, как дНТФ урацила, гипоксантина или ксантина, постоянно присутствуют в клетке и потенциально способны индуцировать мутации. Также, внутриклеточное образование мутагенных аналогов, например, дНТФ 8оксогуанина или 2оксоаденина, может происходить под действием окислительного стресса i, . Экзогенные аналоги оснований, обладающие мутагенными свойствами, могут поступать в клетку из окружающей среды в составе лекарственных противоопухолевых и противовирусных препаратов. В клетке существует тонкая регуляция процессов биосинтеза и утилизации нуклеотидов, направленная на поддержание оптимального состава предшественников ДНК. Поскольку данное исследование посвящено изучению механизмов действия мутагенных аналогов пуринов, кратко рассмотрим метаболизм пуриновых предшественников ДНК, который наиболее хорошо изучен у модельных микроорганимов бактерий . Метаболизм пуринов. Сравнительная характеристика метаболизма пуринов у . Для синтеза пуриновых нуклеотидов используются два принципиально различных пути. Один из них биосинтез пуриновых нуклеотидов v БПН, который осуществляется на уровне нуклеотидов без образования свободных оснований или нуклеозидов. Второй путь использование для синтеза пуриновых нуклеотидов свободных экзогенных, а также эндогенных оснований и нуклеозидов пуринов, образующихся при распаде нуклеиновых кислот. Совокупность этих реакций принято называть путь утилизации и взаимопревращения пуринов УВП. ГМФ, синтезированные v или образовавшиеся из готовых пуриновых оснований и нуклеозидов, используются для биосинтеза дНТФ, являющихся субстратами ДНКполимераз при репликации ДНК. Различные нуклеозидмонофосфаткиназы специфичны к структуре пуринового гетероцикла, но не различают рибо и дезоксинуклеотиды см. Неспецифичная нуклеозидцифосфаткиназа способна фосфорилировать пуриновые и пиримидиновые рибоиуклеозиддифосфаты рНДФ и дезоксирибонуклеозиддифосфаты дНДФ с образованием соответствующих трифосфатов. У бактерий . НДФ, а в анаэробных условиях из рибонуклеозидтрифосфатов рНТФ. У дрожжей биоснтез дезоксинуклеотидов осуществляется только из соответствующих рНДФ посредством единственного фермента рибонуклеозиддифосфатрсдуктазы РНР. Бактериальная и дрожжевая РНР состоят из двух субъединиц В1 и В2 см. Большая субъединица бактериальной РНР состоит из двух полипептидов равного размера а и а. Оба мономера а и а, имеющие одинаковую последовательность Сконцевого участка и отличающиеся последовательностью конца, кодируются геном . Матричные РНК для синтеза полипептидов а и а являются таким образом продуктами процессинга одной мРНК. Субъединица В2 состоит из двух идентичных полипептидов, кодируемых геном . Активный сайт фермента РНР включает ионы железа и тирозильные радикалы, связанные с субъединицей В2, а также тиольные группы субъединицы В1.