Полиморфные молекулярно-генетические маркеры и определение их аллельного статуса в сложных смесях молекул нуклеиновых кислот

• Автор: Ребриков, Денис Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы сравнения двух образцов ДНК

1.2. Методы ПЦР в реальном времени

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование возможностей метода вычитающей гибридизации нуклеиновых кислот.

3.2. Создание метода определения однонуклеотидных полиморфизмов с использованием термостабильной дуплексспецифичной нуклеазы.
3.3. Усовершенствование технологии детекции однонуклеотидных полиморфизмов на основе аллельспецифичной полимеразной цепной реакции с использованием
ПЦР в реальном времени с флуоресцентномечеными ол иго нуклеотидным и пробами или праймерами.
3.4. Разработка алгоритма проведения исезедования и анализа
результатов ПЦР в реальном времени, повышающего точность и воспроизводимость метода.
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Методы дифференциального дисплея. В году был предложен новый подход к поиску транскриптов дифференциально экспрессирующихся генов i , . ДД. Метод включает следующие стадии а из каждого из сравниваемых образцов РНК производят упрощенные образцы фрагментов кДНК т. ДНК таким образом, что их состав жестко определяется конкретными условиями получения такие образцы называют субпопуляциями б аналогичные субпопуляции, полученные из сравниваемых образцов РНК, разделяют на соседних дорожках полиакриламидного геля получаемые картинки из исторических соображений называют фннгерпринтами в полосы фрагментов кДНК, видимые только в одном из сравниваемых образцов или гораздо более выраженные в одном из образцов экстрагируют из геля и изучают такие фрагменты потенилыю относятся к транскриптам дифференциально экспрессирующихся генов г чтобы сравнить уровень экспрессии для возможно большего числа генов изменяют параметры получения субпопуляций, производя субпопуляции другого состава и изучают вышеописанным образом. Преимущество такого подхода по сравнению с дифференциальным скринингом очевидно вместо проведения отдельного раунда гибридизации для каждой из случайно выбранных последовательностей, сравнивают уровень представленности сразу нескольких десятков видов мРНК. Еще одним очень важным свойством ДД является возможность одновременного анализа нескольких образцов РНК, что практически невыполнимо в случае дифференциального скрининга с использованием вычитающей гибридизации. В последующие годы ДД широко применялся для решения разнообразных задач, что привело к появлению нескольких сотен публикаций. Тем не менее выяснилось, что техника ДД скрывает гораздо больше подводных камней, чем можно было предположить исходя из первых описаний , . ДД i , . . . В наиболее раннем варианте метода ДЦ i , . ДНК использовали ПЦР со случайным затравлением В этом случае уменьшение сложности образца кДНК достигается за счет того, что один из праймеров, используемых в таком ПЦР,. ДЫК, в которых присутствует соответствующий комплементарный или частично комплементарный участок. В результате каждый фингерпринт выглядит как хорошо различимых полос и представляет собой случайную выборку кДНК фрагментов из общего пула мРНК. При использовании иного праймера будет получена другая выборка. Очевидно, эти выборки могут перекрываться, поскольку ничто не мешает одному и тому же виду кДНК быть амплифицированным при помощи более чем одной комбинации праймеров. Такой подход не позволяет провести исчерпывающий анализ всего образца мРНК с целью обнаружения всех ДПП. Чтобы сделать технологию ДЦ столь же эффективной для исчерпывающего анализа пула мРНК сколь и для частичного его изучения, несколькими группами были разработаны методы, использующие альтернативную стратегию подразделения мРНК на субпопуляции. Эта стратегия может быть названа систематической выборкой в отличие от исходной случайной выборки. Ее наиболее важным свойством является то, что некий вид мРНК может быть обнаружен в одной и только в одной субпопуляции таким образом, субпопуляции являются неперекрывающимися. При этом для анализа всего пула мРНК необходимо просмотреть ровно столько полос на фишерпринтах, сколько имеется видов мРНК в образце. V . Схема метода систематического ДЦ включает две стадии . ДНК, в котором каждый вид мРНК представлен единственным фрагментом характерной длины 2 получение неперскрывающихся субпопуляций этих фрагментов или их производных, включающих по 0 фрагментов такого размера, чтобы они эффективно разделялись в полиакриламидном геле. Субпопуляции, полученные из сравниваемых образцов РНК, затем исследуют так же, как и при классическом ДЦ. Что касается первой стадии, все описанные методы систематического ДЦ направлены на выделение Зконцсвых заканчивающихся полиАпоследовательностыо фрагментов, полученных после обработки кДНК эндонуклеазой рестрикции.