Функциональная характеристика репликона бактериофага N15 и конструирование на его основе экспрессионных векторов с регулируемым числом копий

• Автор: Марданов, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Репликация кольцевых бактериальных плазмид.

1.1 Сайты инициации репликации

1.2 Репликационный аппарат .i

1.3 Инициация и элонгация репликации, зависящие от плазмидных белков.

1.4 Репликация фагаплазмиды Р

1.5 Репликация по механихму вытеснения цепи i ii

1.6 Репликация по механизму катящегося кольца

2. Регуляция репликации и числа копий плазмид

2.1 Контроль с помощью антисмысловой РНК.
2.2 Контроль числа копий с помощью репрсссора транскрипции и антисмысловой РНК.
2.3 Регуляция с помощью итеронов.
3. Векторы для экспрессии белков в клетках . i.
3.1 Регулируемые промоторы.
3.2 Плазмидный репликон
4. Особенности генетики и механизма репликации ДНК бактериофага
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Механизмы регуляции числа копий лрофагаЫ
1.1 Идентификация промотора гена герА и изучение влияния СВ репрессора на
уровень транскрипции герА
1.2. Анализ роли антирепрессоров в регуляции числа копий и уровня транскрипции герА
1.3 Анализ взаимодействия репрсссорантирепрессор в бактериальной двугибридной системе.
2. Функциональная характеристика репликационного гена г ер А.
2.1 Анализ аминокислотной последовательности А белка.
2.2 Репликация миниплазмид, основанных на репликоне , в штаммах . i, содержащих температурночувствительные мутации в генах, существенных для репликации
2.3 Литическое развитие фага в штаммах содержащих температурночувствительные мутации в генах, существенных для репликации.
2.4 Зависимость репликации фага от клеткихозяина.
2.5 Репликация не зависит от хеликазы . i
2.6 Функциональная роль потенциального бокса в i сайте
3. Экспрессионные вектора на основе репликона фага .
3.1 Конструирование серии экспрессионных Е векторов.
3.2 Конструирование штамма . i I.
3.3 Регуляция числа копий векторов.
3.4 Стабильное наследование векторов в штамме
3.5 Диапазон регуляции синтеза продукта в экспрессионных системах
3.6 Клонирование и экспрессия гена эндонуклеазы рестрикции 8i.
ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Регуляция репликации и конроль числа копий профага
2. Функциональная характеристика герА
3. Роль инициаторного белка . i в регуляции репликации .
4. Векторы для экспресии белков в клетках . i на основе репликона .
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА.
ВВЕДЕНИЕ


Функциональная характеристика репликационного гена герА и установление роли репликационных белков клеткихозяина в репликации профага и ДНК фага в ходе литического развития. Конструирование и характеристика экспрессионных векторов на основе репликона , число копий которых может регулироваться. Плазмиды являются автономно реплицирующимися экстрахромосомными элементами. Они были обнаружены в организмах, представляющих все три класса живых существ , i, и . Плазмиды могут содержать существенную долю общей генетической информации организма, которая достигает у некоторых представителей . Плазмиды могут включать и переносить гены за счет рекомбинации или транспозиции, таким образом, способствуют генетическому обмену в бактериальных популяциях. Характерной чертой плазмид является то, что их репликация является автономной и контролируемой. Известны три принципиальных механизма репликации кольцевых плазмид, а именно тетамеханизм, вытеснение цепи и механизм катящегося колеса . История исследований репликации плазмид привела к идеи о том, что тстарепликация чаще встречается в грамотрицательных бактериях, в то время как репликоны более характерны для грамположительных бактерий. Впоследствии, эта точка зрения не подтвердилась, но, тем не менее, большая часть информации о механизмах тетарепликации получена в результате изучения репликонов грамотрицательных бактерий, в то время как информация о плазмидах основана на данных, полученных для грамположительных микробов. Механизм вытеснения цепи характерен для плазмид I семейства. В данном обзоре в первую очередь будет расмотрен тетамеханизм репликации, поскольку именно по этому механизму происходит репликация профага vi . Как правило, плазмиды содержат так называемый существенный район, необходимый для их репликации и контроля числа копий, а также гены, которые могут рассматриваться как несущественные для поддержания плазмиды, кодирующие функции конъюгативного переноса, устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам, и др. Существенный район плазмид содержит три функциональных элемента 1 сайт инициации репликации , 2 гены, кодирующие белоки, участвующие в инициации репликации обычно называемый , хотя известны плазмиды, их не имеющие, 3 плазмидиые гены, контролирующие репликацию и число копий. Тетамеханизм репликации предполагает первоначальное расплетение цепей ДНК, синтез РНКпраймера и инициацию синтеза ДНК путем его расширения , . Синтез ДИК является непрерывным по одной цепи ведущей и прерывающимся по отстающей цепи, хотя синтез обеих цепей происходит координировано обзоры , и vi i, . Репликация может инициироваться с одного или нескольких опсайтов и быть одноили двунаправленной. Интермедиаты, образующиеся в процессе репликации, имеют вид греческой буквы 0, что и дало название этому механизму репликации. Практически все плазмиды, использующие тетамеханизм репликации, кодируют собственные белки. Некоторые репликоны могут зависить от бактериальной ДНКполимеразы I , необходимой на ранних стадиях инициации синтеза ведущей цепи. Большинство плазмид, реплицирующихся по тетамеханизму, кодируют собственные белки и, соответсвенно, содержат сайты его связывания в пределах о7района. Другими характерными чертами опсайтов см. АТбогатого района, в котором происходит первоначальное расплетение нитей и сборка репликационного комплекса, и 2 один или несколько сайтов связывания бактериального инициаторного белка сайты i , , , . Множественные сайты метилирования присутствуют в сайте инициации репликации хромосомы . С, а также многих плазмид, например I . Сайты инициации репликации могту также содержать сайты связывания бактериальных структурных регуляторных белков I ii иили I ivi ii. Эти факторы обеспечивают пространственную близость различных компонентов опсайта или нескольких iсайтов одной плазмиды напр. Эти сайты являются существенными компонентами сайта инициации репликации, поскольку они необходимы для правильной сборки репликационного комплекса i ii , i . Сайты связывания структурных белков также присутствуют в i сайте .