Сегрегация хромосом и митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши

• Автор: Мензоров, Алексей Гавриилович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 103 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ф ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эмбриональные стволовые клетки как связующее звено исследований проблем эмбриональной диффереицировки в системах i vi и i viv

1.1.1. Общая характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения

1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки

1.1.3. Культивирование эмбриональных стволовых клегок

1.1.4. Диффсрсицировка эмбриональных стволовых клеток i vi.

1.1.5. Диффсрсицировка эмбриональных стволовых клеток i viv

1.2. Применение эмбриональных стволовых клеток.
1.3. Гибридные клетки между стволовыми и дифференцированными клетками как модель для изучения процессов репрограммирования.
1.4. Сегрегация хромосом в гибридных клетках.
1.5. Использование микросатсллитов в качестве генетических маркеров
1.6. Роль митохондрий в нормальном развитии, экспериментально реконструированных зиготах и гибридных клетках.
1.6.1. Организация митохондрий млекопитающих.
1.6.2. Сегрегация мтДНК у клонированных млекопитающих, полученных методом трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты.
1.6.3. Сегрегация мтДНК при гстсроплазмии
1.6.4. Сегрегация мтДНК в гибридных клетках
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клетки и клеточные линии
2.2. Работа с культурами клеток
2.2.1. Пассирование клеток.
2.2.2. Субклонированис.
2.2.3. Замораживание клеток
2.2.4. Размораживание клеток.
2.3. Выделение геномной ДИК.
2.4. ПЦРанализ микросателлитов.
2.4.1. Условия ПЦР для амплификации мнкросатсллитов.
2.4.2. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.
2.5. Анализ мтДНК.
2.5.1. ПЦР фрагментов мтДНК.
2.5.2. Выделение амплифицированного фрагмента ДНК.
2.5.3. Подготовка фрагмента мтДНК для секвенирования
2.5.4. Секвенирование мтДНК.
2.6. Рестрикционный анализ мтДНК
2.7. ПЦРанализ мтДНК единичных клеток
2.8. Цитогенетический анализ
2.8.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом.
2.8.2. Подсчет хромосом.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Идентификация родительских хромосом в гибридных клетках типа ЭСспленоцит и ЭСфибробласт с помощью полиморфных мнкросатсллитов.
3.1.1. Выбор микросателлитных маркеров, дискриминирующих гомологичные хромосомы мышей линий 9а, ЭЭс и мышей М. сагоИ
3.1.2. Оптимизация условий ПЦР для алельных вариантов микросатсллитов у мышей линий 9Ю1а и ОЭс.
3.1.3. Оптимизация условий ПЦР для анализа аллельных вариантов микросателлитов мышей М. тазси1т и М. сагоИ.
3.2. Сегрегация хромосом в клонах внутривидовых гибридных клеток
3.3. Сегрегация хромосом в клонах межвидовых гибридных клеток.
3.4. Сегрегация митохондрий в клонах внутривидовых гибридных клеток.
3.5. Сегрегация митохондрий в клонах межвидовых гибридных клеток
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Прямые доказательства масштабного рспрограммирования генома соматического партнера фибробласта и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов свыше по типу ЭС клеток были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов ЭС клеток человека с фибробластами . Сопоставление процессов репрограммирования в ядрах дифференцированных клеток после их переноса в энуклеированный ооцит или яйцо с таковыми в гибридных клетках типа ЭСсоматическая клетка показывает значительное сходство и, следовательно, гибридные клетки являются новым перспективным инструментом изучения фундаментальных проблем репрограммирования и восстановления проспективных потенций генома дифференцированных клеток. Однако при этом следует особо отметить, что для изучения молекулярных механизмов как поддержания плюрипотснтности в гибридном геноме, так и репрограммирования генома соматического партнера необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток. Между тем, до недавнего времени исследованиям этой важной характеристики гибридных клеток типа ЭСдифференцирован пая клетка не уделялось должного внимания. В ряде работ по слиянию ЭС и дифференцированных клеток авторы не исследовали кариотип гибридных клеток на том основании, что клетки имели тетраплоидиый набор хромосом, что, как полагают авторы, свидетельствует об отсутствии сегрегации хромосом. Так, Тада и соавторы . ЭС клеток и тимоцитов, околотетраплоидпый набор хромосом, по их мнению, сохранившийся от момента слияния двух диплоидных клеток. Тетраплоидный набор хромосом был обнаружен в гибридных клетках, полученных от спонтанного слияния ЭС клеток со стволовыми клетками костного мозга или недифференцированными клетками головного мозга эмбрионов . Однако, согласно более поздним данным Тада и соавторов . ЭС клеток мыши с тимоцитами, сохраняли тетраплоидный набор хромосом. Болес того, интенсивная сегрегация хромосом была отмечена в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС клеток и спленоцитов, в результате чего кариотипы некоторых клонов гибридных клеток содержали околодиплоидный набор хромосом vv . Матвеева и др. Сходные данные были получены при исследовании количества хромосом в гибридных клетках, образовавшихся от спонтанного слияния i viv незрелых клетокпредшествешшков гемопоэза с клетками печени . Между тем, дискриминация родительских хромосом возможна с использованием альтернативных методов, например, с помощью микросателлитов в качестве маркеров хромосом. Микросатсллиты высокополиморфны у лабораторных линий мышей и равномерно распределены в геноме мыши ii . В году появилась одна из первых работ, в которой микросателлиты использовали для маркирования родительских хромосом у внутривидовых гибридных клеток i . Авторы использовали набор микросателлитов, дискриминирующих вес гомологичные хромосомы, представленные в геноме гибридных клеток от разных линий мышей. Анализ микросателлитов позволил выявить направленность сегрегации в зависимости от фенотипа гибридов. При образовании гибридных клеток происходит объединение не только ядериых геномов, но и цитоплазмы родительских клеток. Как отмечалось выше, имеются противоречивые и неполные данные о судьбе родительских хромосом в геноме гибридной клетки. В то же время, сведения об организации гибридной цитоплазмы практически полностью отсутствуют. Учитывая способность митохондриальной ДНК мгДНК к репликации, представляется актуальным изучение взаимоотношений родительских митохондриальных геномов в гибридной цитоплазме, что может пролить свет на се организацию. Следует также отмстить, что, согласно некоторым данным, существует взаимосвязь между сегрегацией хромосом и митохондрий. Так, в гибридных клетках от слияния между клетками человека и мыши происходит сегрегация митохондрий того партнера, чьи хромосомы теряются . Гибридные клетки от слияния клеток мыши и китайского хомячка, а также мыши и крысы, сохраняли как хромосомы, так и митохондрии обоих партнеров i . В настоящее время отсутствуют данные о судьбе родительских митохондрий как во внутривидовых, так и межвидовых гибридных клетках, полученных от слияния диплоидных ЭС клеток с диплоидными дифференцированными клетками.