Неравный кроссинговер в гетерозиготных тандемных дупликациях у Escherichia coli

• Автор: Прокопьев, Василий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 94 с. : ил.

1 .Неравный кроссинговер в тандемных дупликациях.

1.1. Неравный кроссинговер у ii i

2. Модельная система для изучения гомологичной рекомбинации

2Л.0еооперон

2.2. Получение тандемных дупликаций

2.3. Механизм образования тандемных дупликаций.

2.4. Изучение гомологичной рекомбинации в модельной

системе 5 .

3. Генная регуляция хромосомных перестроек.

3.1. Генная регуляция рекомбинации прокариот.

3.2. Влияние основных путей рекомбинации на частоту образования дупликаций и межсестинский обмен в
гетерозиготных тандемных дупликциях
3.3. Эффект мутаций по генам , v, на
образование дупликаций.
3.4. Рекомбинация в гетерозиготных тандемных дупликациях
на фоне мутации по гену гесА.
3.5. Влияние мутаций по генам v на рекомбинацию между прямыми повторами ДНК в штаммах . i, несущих
протяжнные тандемные дупликации.
3. Неравный кроссинговер между сестринскими хромосомами
как путь адаптивной рекомбинации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Объекты и методы исследований.
1. Штаммы и условия культивирования
1.1. Бактериальные штаммы
1.2. Среды и условия культивирования.
1.3. Плазмиды
1.4. Реактивы
2. Методы исследований.
2.1. Генетические методы исследования
2.1.1. Конъюгационное скрещивание
2.1.2 Трансдукционное скрещивание
2.1.3. Анализ генотипа рекомбинантов.
2.1.4 Получение клонов сегрегантов .
2.1.5. Определение свойства
2.1.6. Определение чувствительности клеток к УФсвету
2.2. Молекулярнобиологические методы исследования.
2.2.1. Выделение и очистка хромосомной ДНК.
2.2.2. Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2.2.3. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
2.2.4. Выделение и очистку ДНК из агарозного геля
2.2.5. Секвенирование фрагментов генов оперона.
2.2.6. Выделение плазмидной ДНК методом щелочной экстракции
2.2.7. Трансформация ДНК в . i.
2.2.8. Исследование уровня экспрессии гесА.
2.3. Компьютерный анализ.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
1. Определение вероятности образования сегрегантов с сохранением тандемного повтора и с образованием гаплоида.
2. Влияние основных путей рекомбинации и на неравный генетический обхмен в гетерозиготных тандемных дупликациях.
3. Определение уровня экспрессии гесИпромотора в исследуемых штаммах с гетерозиготными тандемными дупликациями
4. Роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации, со вставкой транспозона Тп5 в гене еоВ в одной из копий тандема.
5. Роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 8 н.п. затрагивающей гены сеоВ и сеой
одной из копий тандема
Список литературы.
ВВЕДЕНИЕ


Исследование уровня экспрессии гесА. Компьютерный анализ. Глава 3. Результаты и обсуждение. Определение вероятности образования сегрегантов с сохранением тандемного повтора и с образованием гаплоида. Влияние основных путей рекомбинации и на неравный генетический обхмен в гетерозиготных тандемных дупликациях. Роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации, со вставкой транспозона Тп5 в гене еоВ в одной из копий тандема. Роль неравного кроссинговера при гомологичной рекомбинации между повторами гетерозиготной дупликации с нарушением гомологии, связанной с делецией 8 н. Список литературы. В последние годы активно обсуждается феномен взаимоотношений трх основных генетических механизмов рекомбинации, репарации и репликации. Причм наиболее актуальным направлением является выяснение связи между процессами репликации и рекомбинации. Большинство исследований в этой области направлены на изучение роли белков участвующих в этих процессах, таких как , , , v, и других. В генетическом контексте важное место в изучении взаимосвязи репликации и рекомбинации занимают исследования рекомбинации в тандемных дупликациях у бактерий. В таких генетических системах генетический обмен может приводить, прежде всего, к гаплоидизации, т. Показано, что частота образования делеций в тандемных дупликациях зависит от состояния генов, кодирующие основные ферменты репликации ДНКполимеразу III и геликазу репликационной вилки v . Правда в некоторых случаях образование делеций тандемными дупликациями может быть независимым. В подавляющем большинстве работ, связанных с изучением рекомбинации в дупликациях, используются относительно небольшие повторы гомологичных сегментов хромосомы. Но интерес также представляют и более протяженные, включающие от до 0 и более тыс. Исследование полученных рекомбинантов позволяет более детально изучать механизм рекомбинации. Важно отметить, что образование рекомбинантов различного типа, происходящее в условиях селективного давления внешней среды имеет сходство с так называемыми направленными, или адаптивными мутациями, которые во многих отношениях отличаются от спонтанных мутациях в делящихся клетках. Эти мутации возникают только после воздействия нелетальных селективных факторов, при отсутствии клеточного деления и без повышения общего уровня неселектируемых мутаций , . Неравный кроссинговер, происходящий между сестринскими хромосомами у бактерий, как и кроссинговер, происходящий между хромосомами различного происхождения, является непосредственным механизмом, который приводит к образованию тандемных дупликаций, а также множественных амплификаций генов . Для образования тандемных дупликаций путм неравного кроссинговера необходимо, что бы в процессе репликации происходил сдвиг гомологичного соединения сестринских хромосом. Мишенью для неравного кроссинговера при образовании дупликаций и затем областью стыка между двумя гомологичными повторами ДНК служат гомологичные опероны гт рибосомальных РНК . ДНК длинной пн Т. Приято считать, что основной функцией образования дупликаций является повышение активности генов . Изучение рекомбинационных обменов в протяжнных тандемных дупликациях у ii i один из эффективных подходов к выяснению механизмов рекомбинации, а также е связи с такими генетическими явлениями как репарация и репликация. Предыстория работы. В году впервые было сообщено о создании гетерозиготной тандемной дупликации с помощью конъюгационного скрещивания у ii i К Суходолец В. В., . Рис. Получение тандемных дупликаций. Дупликации, полученные в этих скрещиваниях, имели дикий фенотип по генам , и отличались от истинных рекомбинантов Эео сохранением антибиотикоустойчивости наличие транспозонной вставки Тп5 в гене . В тоже время все дупликации имели мутантный фенотип по гену изза полярного эффекта вставки транспозона в предшествующем по направлению транскрипции гене . Другим доказательством образования гетерозиготных дупликаций была их способность к выщеплению сегрегантов родительского типа и Тп5.