Молекулярно-цитогенетическая характеристика прицентромерного гетерохроматина малярийных комаров комплекса Anopheles Maculipennis (Culicidae, Diptera)

• Автор: Грушко, Ольга Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Гетерохроматин как феномен биологии эукариот

1.2. Малярийные комары рода как объект эволюционных

4 исследований

1.3. Гетерохроматин политенных хромосом

1.4. Гстерохроматин политенных хромосом малярийных комаров комплекса ii

1.5. Молекулярный состав гетерохроматина

1.5.1. Белки

1.5.2. Первичные последовательности ДНК гетерохроматина

1.5.3. Композиция последовательностей ДНК в гетерохроматине

1.6. Г етерохроматин и пространственная организация интерфазного ядра ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Получение биологического материала
I 2.2. Приготовление препаратов политенных хромосом
2.3. Микродиссекция и ПЦР с частично вырожденным праймером
2.4. Клонирование амплифицированных фрагментов ДНК
2.5. I i гибридизация
2.5.1. Флуоресцентная i i гибридизация с политенными хромосомами трофоцитов комаров
2.5.2. I i гибридизация клона А,р1.4 на хромосомы слюнных желз дрозофил
2.6. Выделение геномных ДНК
, 2.7. Саузернблотгибридизация с мечеными геномными ДНК
2.8. Саузернблотгибридизация клона 2 2.9. Секвенирование и анализ последовательностей ДНК i ii
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Клонирование и получение районоспецифичной пробы ДНК прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 А.
v методом микродиссекции
3.2. Анализ состава ДНК диффузного прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 . v
3.2.1. Анализ фрагментов на наличие гомологии друг с другом
3.2.2. Анализ фрагментов библиотеки 2 на наличие внутренних тандемных повторов
3.2.3. Поиск гомологичных последовательностей в различных базах данных
3.2.4. Анализ библиотеки 2 на содержание ДНК, взаимодействующих с различными белковыми структурами ядра с помощью программы
3.3. Анализ состава районов гетерохроматина в комплексе ii с помощью i i гибридизации районооспсцифичной пробы прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 . v
3.3.1. I i гибридизация районооспецифичной пробы с политенными хромосомами трофоцитов яичников . v
3.3.2. I i гибридизация районоспецифичной пробы с политенными хромосомами трофоцитов яичников Л.
3.3.3. I i гибридизация районоспецифичной пробы с политенными хромосомами трофоцитов яичников . ivi
3.4. Характеристика повторяющихся последовательностей ДНК прицентромерного гстерохроматина комаров комплекса ii
3.4.1. Выявление консервативных повторов с помощью Саузернблотгибридизации и характеристика их первичных последовательностей
3.4.2. Хромосомная локализация консервативных повторяющихся последовательностей ДНК у . v и .
3.4.3. Организация повторяющейся ДНК, гомологичной фрагменту 2, в геномах комаров комплекса ii
3.5. Хромосомная локализация клона Ар1.4 у видов дрозофил
подгруппы ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Применимость метода микродиссекции для клонирования гетерохроматина
4.2. Анализ гомологии последовательностей библиотеки 2 с базами данных
4.3. Сравнительный анализ общего состава районов гетерохроматина у комаров комплекса ii
4.4. Характеристика повторяющихся последовательностей прицентромерного гетерохроматина комаров комплекса ii
i
4.4.1. Разнообразие повторяющихся последовательностей прицентромерного гетерохроматина
4.4.2. Консервативность повторяющихся последовательностей в комплексе ii
4.4.3. Преобразования хромосомной локализации повторяющихся последовательностей ДНК в комплексе ii
4.5. Молекулярные механизмы прекреплений хромосом к ядерной оболочке
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Список принятых сокращений и обозначений
ПЦР полимеразная цепная реакция с частично вырожденным праймером
кДНК кодирующие ДНК
ix ii i район ассоциации с ядсрным матриксом
М ДНК ДНК ядерного матрикса,
и.о. пар оснований
ПЦР полимеразная цепная реакция
рсДНК ДНК розеткоподобных структур,
скДНКДНК синаптонемного комплекса,
т.и.о. тысяч нар оснований
ялДНК ДНК ядерной ламины
ВВЕДЕНИЕ


На примере многих видовых комплексов показано, что даже близкородственные виды обладают различной способностью к переносу поражающих человека видов малярийных плазмодиев, различной антропофильностыо, различной широтой ареала и численностью, что придает им разную эпидемическую значимость. Для понимания генетических основ этих явлений необходимы всесторонние исследования межвидовых отличий в организации геномов у видов рода . ДНК ответственны за разнообразие структуры прицентромерного гетерохроматина и характера его прикреплений к ядерной оболочке у видов комплекса ii Связано ли образование контактов района прицентромерного гетерохроматина с ядерной оболочкой с содержанием в нем какихлибо специфических последовательностей ДНК Универсальны ли принципы изменений состава прицентромерного гетерохроматина, влияющих на пространственную организацию генома, при видообразовании в отряде двукрылых у и у i Для ответов на эти вопросы необходима характеристика состава ДНК отдельных районов прицентромерного гетерохроматина. Для клонирования и характеристики состава ДНК был выбран район диффузного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 . Рис. Рис. Целью данной работы является характеристика состава ДНК прицентромерного гстерохроматина у видов комплекса ii и поиск молекулярной основы структурной и пространственной изменчивости прицентромерного гетерохроматина, сопровождающей видообразование. ПЦР и клонирования в плазмидном векторе получить районоспецифичную библиотеку ДНК прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 . ДНК прицентромерного гетерохроматина у видов комплекса ii с помощью i i гибридизации районоспецифичной пробы ДНК прицентромерного гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 . ДНК . А. v и . ДНК из диффузного прицентромерного гетерохроматина i обеспечивающей связь гетерохроматина с ядерной оболочкой клон Ар1. ДНК, способных к взаимодействию с белковыми структурами ядра, в видовых комплексах ii и i . Научная новизна исследования заключается в том, что впервые проведено прямое клонирование и изучение состава ДНК района при центромерного гетерохроматина у малярийного комара. Анализ первичной последовательности полученных фрагментов ДНК показал, что прицентромарный гетерохроматин правого плеча хромосомы 2 . ДНК, большинство которых АТбогатые, консервативны в комплексе ii и потенциально способны к взаимодействию с различными белковыми структурами ядра. В составе исследованного района описаны типичные для конститутивного гетерохроматина классы ДНК повторяющиеся последовательности ДНК, мобильные элементы и структурные гены. Оценена эволюционная изменчивость отдельных последовательностей в составе прицентромерного гетерохроматина. Ар1. Мобильные элементы и структурные гены консервативны в отряде двукрылых насекомых, что показано в ходе сравнения фрагментов библиотеки ПГХ правого плеча хромосомы 2 . Впервые продемонстрированы различия районов прицентромерного гетерохроматина разной структуры и отношений к ядерной оболочке у малярийных комаров комплекса ii на уровне состава ДНК. ДНК. Кроме того, обнаружено, что состав каждого района прицентромерного гетерохроматина у малярийных комаров комплекса ii уникален по композиции повторяющихся последовательностей ДНК. Показано, что структура района прицентромерного гетерохроматина и его прикрепление к ядерной оболочке как у i, так и у напрямую не связаны с наличием либо отсутствием в его составе последовательностей ДНК, способных к взаимодействию с белковыми структурами ядра. Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссскция и ПЦР проводились совместно с д. Н. Б. Рубцовым и к. Т. В. Карамышевой. Эксперименты по Саузернблотгибридизации и секвенированию с к. А. И. Шевченко и к. М. В. Шараховой. I i гибридизации проводились при участии к. И. В. Шарахова и В. А. Тимошевского. Описан состав ДНК гетерохроматина . ДНК гетерохроматина у малярийных комаров комплекса ii. Подтверждается универсальность принципов организации прицентромерного гетерохроматина у двукрылых насекомых. Полученная библиотека клонов ДНК гетерохроматина правого плеча хромосомы 2 .