Молекулярно-генетическое исследование биогенеза фотосистем I и II у цианобактерии Synechocystis 6803

• Автор: Ивлева, Наталья Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Л.Экспериментальные модели для изучения генетического

контроля биогенеза фотосистем I и II

1.2.Генетический контроль биогенеза ФС

1.2Л. Генетический анализ структуры и функции ФС

1.2.2. Организация и действие генов, контролирующих

биогенез ФСИ

1.2.3. Г енетический контроль биогенеза белка Э1

1.2.3Л. Контроль экспрессии рьЬА генов

1.2.3.2. Роль карбоксилтерминалыюго участка белка

в биог енезе ФСИ
1.2.3.3. Функция гена срЛ и его гомологов в геноме Зупескосузя
1.2.4. Экспрессия генов, кодирующих другие субъединицы ФСИ
1.2.5. Роль структурных генов ФС в процессе
сборки комплекса
1.3.Генетический контроль биогенеза ФС
1.3.1. Генетический анализ структуры и функции ФС
1.3.2. Организация и действие генов, контролирующих
биогенез ФС
1.3.3. Роль структурных генов ФС в процессе сборки комплекса
1.3.4. Роль геновсЗ и ус4 в сборке и функции ФС
1.4.Генетические стратегии, используемые для изучения механизмов биогенеза фотосистем
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 .Среды и культивирование микроорганизмов
2.2.Бактериальные штаммы и плазмиды
2.3.Трансформация бактериальных клеток
2.4.Молекулярное клонирование
2.5.Изолирование мембранной фракции клеток БупесИосузШ , гельэлектрофорез и иммунодетекция белков
2.6.0пределение скорости выделения поглощения
кислорода клетками
2.7.Содсржание пигментов и спектроскопический анализ
2.8. Измерение медленной, низкотемперату рной и
переменной флюоресценции
2.9.Фотоингибирование и восстановление активности ФС
2 Опыты со смешанными культурами
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕННОЕ
3.1.Изучение физиологической роли карбоксилтерминального участка белка фотосистемы II
3.1.1. Конструирование штаммов с мутациями в белке
3.1.2. Изучение физиологических характеристик мутантов
3.1.3. Опыты со смешанными культурами
3.1.4. Фотоингибированис и восстановление активности ФС
3.1.5. Обсуждение роли карбоксилтерминального участка
белка Э1 в биогенезе ФС
3.2.Изучение функциональной роли генов ср семейства
с помощью геннаправленного мутагенеза
3.2.1. Конструирование делеционных мутантов
по генам сгр семейства
3.2.2. Ростовые и фотосинтетическис характеристики
мутантов Дс1рВ и ДарАДсгрВ
3.2.3. Обсуждение функциональной роли генов с1р семейства
3.3.Изучение роли генов усЗ и ус4 в регуляции
биогенеза фотосистемы I.
3.3.1. Конструирование инсерционных мутантов усО и ус4
3.3.2. Ростовые и фотосинтетическис характеристики
ус Г3 и ус4 мутантов
3.3.3. адичие белков ФС1 и ФСН в клетках усП и ус4 мутантов
3.3.4. Изучение влияния высокой интенсивности света
на клетки усП и усГ4 мутантов
3.3.5. Обсуждение роли усЗ и ус4 генов в биогенезе ФС1
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДФ аденозиндифосфат
АТФ аденозинтрифосфат
НАДФН никотинамиддинуклеотидфосфат
п.н. пар нуклеотидов
г.п.н. тысяч пар нуклеотидов
ГТЦР полимеразная цепная реакция
ФС1 фотосис тема I
ФСИ фотосистема II
ОСМи ,4дихлорфенил1,1ДИметилмочевина Отк устойчивость к гентамицину Етк устойчивость к эритромицину Кшк устойчивость к канамицину
ВВЕДЕНИЕ


Благодаря этому, цианобактерии активно используются в качестве модельных объектов генетики оксигенного фотосинтеза. У фотогетсротрофной цианобактерии i . РСС далее обозначаемой как i геном полностью секвенирован . Это позволяет находить в банке данных последовательности ДНК, гомологичные таковым у высших растений, и проводить их геннаправленный мутагенез, то есть использовать для функционального анализа генов прием обратной генетики от гена к фенотипу. Диссертация посвящена молекулярногенетическому исследованию различных звеньев биогенеза ФС1 и ФС у цианобактерии i . Исследование физиологической роли карбоксилтерминального участка белка 1 фотосистемы II. Изучение функциональной роли генов семейства с помощью геннанравленного мутагенеза. Изучение роли генов 4 в регуляции биогенеза фотосистемы I. Фотосистема I ФС1 и фотосистема II ФСП это два больших комплекса, содержащих белки и пигменты, которые находятся в гилакоидных мембранах хлоропластов высших растений и эукариотических водорослей, а также в цианобактериях. Обе фотосистемы имеют специальные хлорофиллсодержащие реакционные центры РЦ, которые поглощают энергию света, инициируя серию восстановительноокислительных реакций, обеспечивающих образование высокоэнергетичных молекул АТФ и НАДФН. В процессе этих реакций электрон перемещается от молекулы воды первоначального донора к молекуле НАДФ конечному акцептору, проходя от ФСП к гидрофобному переносчику пластохинону РС, затем к мембранному комплексу цитохрома Ь6 а затем через пластоцианин или цитохром с3 достигает ФС1 рис. Этот индуцируемый светом перенос электронов взаимосвязан с переносом протонов через тилакоидную мембрану, в результате которого происходит повышение концентрации протонов в люмене тилакоидов. Энергия этого протонного градиента используется для синтеза АТФ с участием АТФ синтетазы. В течение последних лет было опубликовано большое количество работ, посвященных биогенезу ФС1 и ФСП. В большинстве из них обсуждались сведения, полученные с помощью методов геннаправленного или случайного мутагенеза, использованных для анализа генетического контроля биогенеза отдельных субъединиц и целых комплексов, а также взаимосвязи процессов регуляции биогенеза с другими метаболическими системами в клетке. Рис. Схема тилакоидной мембраны, показывающая взаимосвязь между фотосинтетическим транспортом электронов н синтезом АТФ. Ьу комплекса, ФС1 и ФСН, показаны белыми прямоугольниками. Горизонтальные стрелки показывают транспорт электронов, вертикальные транспорт протонов. Р пластохинон цитЬ цитохром Ь6Г РС пластоцианин. В биогенезе ФС1 и ФСП можно выделить три основных взаимосвязанных этапа 1 биогенез белков и их кофакторов 2 транспорт и встраивание этих белков в тилакоидные мембраны 3 сборка этих белков в фотосинтетические комплексы. Генетический контроль синтеза отдельных компонентов фотосистем является важным фактором структурнофункциональной организации аппарата фотосинтеза, так как сборка комплексов и их активность прямо зависит от наличия и количества тех или иных белков и кофакторов. В то время как у прокариот этот контроль в основном но не только осуществляется на уровне транскрипции, у эукариот регуляция сборки и функционирования фотосистем происходит преимущественно на трансляционном уровне. Некоторые белки подвергаются также посттрансляционным модификациям. Встраивание в тилакоидные мембраны цианобактериальных белков и белков, кодируемых хлоропластными генами у эукариот, может осуществляться во время или после трансляции. Белки, кодируемые ядерными генами и синтезируемые в цитоплазме, должны быть транслоцированы через хлоропластную мембрану. Этот процесс обычно осуществляется с помощью Ытерминальных сигнальных последовательностей транспортируемых белков и их последующего процессинга специфическими лидериыми пептидазами. Этот этап заключается в узнавании субъединиц и их взаимодействии, обеспечивающем сборку функциональных фотосистем. Это происходит как в результате самосборки, так и под контролем генов, кодирующих специфические белки шапероны.