Молекулярно-генетический анализ участка ДНК Drosophila melanogaster, содержащего жизненно-важный ген l(1)ts403

• Автор: Третьякова, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 160 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Температурный стресс и белки теплового шока БТШ

1.1. Роль температуры в процессах жизнедеятельности организмов

1.2. БТШ белки стресса

1.3. Функции БТШ

1.4. Регуляция экспрессии генов БТШ

1.5. БТШ и мутационный процесс

2. Мутантная линия дрозофилы 3 как модель для изучения последствий теплового шока
2.1. Влияние мутации 3 на экспрессию генов БТ1 после ТШ
2.2. Влияние мутации 3 па плодовитость самок, подвергнутых ТШ
2.3. Влияние мутации 3 на пролиферацию и конденсацию хроматина в соматических клетках у личинок, подвергнутых ТШ
2.4. Влияние мутации 3 на расхождение и потери половых хромосом в мейозе у самок, подвергнутых ТШ
2.5. Влияние мутации 3 на раннее развитие эмбрионов дрозофилы, подвергнутых ТШ
3. Генетические и цитогенетические данные о картировании локуса i, содержащего мутацию 3
4. Резюме
Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
1.1. Линии i , использованные в работе
1.2. Штаммы ii i, использованные в работе
1.3. Библиотеки и клоны геномной ДНК дрозофилы
1.4. Векторы для конструирования рекомбинантных плазмид
2. Методы исследования
2.1. Методы работы с дрозофилой
2.1.1. Условия содержания культур дрозофилы
2.1.2. Получение гибридов дрозофилы, несущих различные комбинации аллелей локуса
2.1.3. Экспериментальный тепловой шок
2.2. Методы работы с микробиологическими объектами
2.3 Электрофоретический анализ белков теплового шока
2.4. Электрофоретический анализ ДНК
2.5. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.6. Препаративное выделение фрагментов ДНК
2.7. Переклонирование фрагментов ДНК в плазмидные векторы
2.8. Трансформация ii i плазмидной ДНК
2.9. Быстрый лизис бактерий
2 Выделение плазмидной ДНК
2 Выделение ДНК клонов Р1
2 Скрининг геномной библиотеки дрозофилы
2 Включение радиоактивной метки в ДНК
2 Гибридизация ДНКДНК
2 Радиоавтография
2 Отбор рекомбинантных фаговых клонов
2 Выделение ДНК бактериофага X
2 Построение рестрикционных карт рекомбинантных клонов
2 Прогулка по хромосоме
2 Определение ориентации вновь выделенного клона геномной
ДНК дрозофилы
2 Выделение геномной ДНК дрозофилы
2 Гибридизация i i с ДНК политснных
хромосом дрозофилы
2 Выделение ро1уАмРНК из самок дрозофилы
2 гибридизация
2 Секвенирование ДНК по Сэнгеру
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2 Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей
2 Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Определение локализации гена, мутация которого приводит к нарушению картины синтеза БТШ после теплового шока у дрозофилы
2. Определение характера доминирования мутации I3 по признаку нарушения картины синтеза БТШ после теплового шока
3. Исследование влияния мутации 3 на сплайсинг мРНК
4. Клонирование последовательности ДНК Ххромосомы i , содержащей ген 3
4.1. Прогулка по хромосоме
4.2. Выбор и картирование клона Р1, содержащего ген 3
5. Молекулярногенетическая характеристика района ДНК дрозофилы, содержащего ген 3
5.1. Секвенирование фрагментов ДНК в области локализации гена 3 и установление их соответствия с опубликованными в
Интернете последовательностями генома дрозофилы
5.2. Выявление экзонинтронной структуры гена
5.3. Идентификация гена яЬг 3 в пределах клонированного нами участка ДНК
5.3.1. Данные о генах, гомологичных зЬг и описанных у других организмов
5.3.1.1. Гены ТАРМехр ортологи гена зЬг
5.3.1.2. Транспорт мРНК из ядра в цитоплазму
5.3.1.3. Экспериментальная изученность генов ТАРМехр
5.3.1.4. Доменная структура факторов ТАРМехр
5.3.2. Сравнение ортологичных белков ТАРМех6г
5.3.3. Выявление фракций мРНК, считывающихся с участка ДНК, в котором локализуется ген й3
5.3.4. Создание конструкции для трансформации мутантных эмбрионов дрозофилы
5.3.4.1. Определение регуляторных районов гена
5.3.4.2. Трансформация клеток зародышевого пути эмбрионов дрозофилы линий, несущих мутации в локусе эЬг
5.3.4.3. Анализ результатов трансформации дрозофилы
5.3.5. Выявление межлинейного рестрикционного полиморфизма
ДНК в районе локализации гена т5
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Никитина, и двигательную активность имаго Машоп е а. Причем, не все проявления исследуемой мутации обусловлены нарушениями в синтезе БТШ после теплового воздействия Мамон и др. Таким образом, мутация 3 затрагивает ген дрозофилы, вовлеченный в различные жизненноважные процессы, характеризующиеся эволюционным консерватизмом, такие как ответ клетки на тепловой шок и процесс расхождения хромосом в мейозе. Цель данной работы состоит в исследовании молекулярной структуры и функции жизненно важного гена 3, вовлеченного в контроль важнейших клеточных процессов, в том числе реакцию клеточного стресса. Используя серию перекрывающихся делений, определить локализацию гена, мутация которого приводит к нарушению картины синтеза Б1Ш после ТШ. Определить характер доминирования для мутантного 3 и нормального аллелей данного гена по признаку нарушения синтеза БТШ после ТШ. Методом гибридизации РНКДНК проверить, влияет ли мутация 3 на сплайсинг мРНК гена . Клонировать последовательность ДНК Ххромосомы i , содержащую ген 3. Секвенировать фрагменты нуклеотидной последовательности ДНК из области локализации гена 3 и установить их гомологию с опубликованными в Интернете последовательностями генома дрозофилы. Дать молекулярногенетическую характеристику района ДНК, в котором локализуется ген 3. Научная новизна и значимость работы. Впервые клонирован в виде серии перекрывающихся фаговых клонов участок Ххромосомы i протяженностью около т. Впервые выявлены 2 перекрывающихся гранскрипта, считываемые с участка ДНК, содержащего ген 3. Впервые для нескольких линий i описан межлинейный полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, образуемых при гидролизе эндонуклеазой рестрикции i и выявляемых при гибридизации с зондом из области локализации гена 3. Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные нами клоны были использованы в работе Е. Б.Кокоза Кокоза, , iv, для выявления в геноме дрозофилы диспергированных повторов, специфичных для половой хромосомы. Фаговые и плазмидные клоны, полученные в данной работе, используются в учебном процессе на кафедре генетики и селекции СПбГУ в практических курсах для студентов и магистрантов. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях на Лобашевских чтениях, посвященных летию М. Питтсбург, Международных конференциях по дрозофиле на II Съезде ВОГиС Санкт етербург, . Публикации. По материалам диссертации опубликовано работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 0 страницах, состоит из Введения, Материалов и методов, Результатов и обсуждения. Заключения и Выводов, трех Приложений содержит рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 9 названий, из которых на русском языке. Все климатические зоны нашей планеты заселены живыми организмами. Жизнь существует в самых различных температурных условиях от горячих источников до соленых арктических озер с температурой воды ниже ОС. Рассматривая эти вопросы, В. Александров приходит к выводу о том, что активная жизнь может существовать на протяжении всей температурной зоны, в пределах которой вода существует в жидком состоянии Александров, . Очевидно, это результат длительной эволюции, которая привела к выработке различных приспособительных механизмов у видов, обитающих в различающихся температурных условиях. Поскольку все термодинамические и кинетические константы биохимических реакций, конформационных переходов биологических макромолекул, фазовых переходов липидов, изменений агрегатного состояния воды зависят от температуры, любое изменение температуры влияет на процессы жизнедеятельности в организме. Однако нормальная жизнедеятельность клеток и организмов может сохраняться в довольно значительных интервалах температур. Эта относительная независимость живых организмов от колебаний температуры обеспечивается целым рядом приспособлений на всех уровнях организации жизни, выработанных в ходе эволюции Александров, . Ответом клетки на экстремальные воздействия, такие, как II, аноксия, ионы тяжелых металлов, аналоги аминокислот, спирты, многие биологически активные вещества и др.