Селекция и конструирование штаммов молочнокислых бактерий, перспективных для использования в пробиотиках

• Автор: Карпушина, Светлана Григорьевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Пробиотики.

1.1.1. Роль кишечной микрофлоры з функционировании организма

животных

1.1.2. Общая характеристика и свойства пробиотиков

1.1.3. Получение пробиотиков на основе микроорганизмов симбионтов пищеварительного тракта
1.2. Бифидобактерии как важнейшие обитатели желудочнокишечного тракта и важнейший компонент пробиотиков

1.3. Лзктобациллы.

1.3.1. Таксономия лактобацилл и их биологические свойства

1.3.2. Антагонистическая активность лактобацилл и других молочнокислых бактерий

1.3.3. Антибиотикорезистентность лактобацилл
1.3.4. Лактобациллы как объект генетических манипуляций.
1.3.4.1. Плазмиды лактобацилл.
1.3.4.2. Репликация плазмид лактобацилл
1.3.4.3. Векторы для лактобацилл.
1.4. Конъюгация у бактерий
1.4.1. Механизмы конъюгации у грамотрицательных бактерий
1.4.2. Конъюгативный перенос плазмид в клетки грамположительных
бактерий
1.4.3. Конъюгативная мобилизация
Заключение.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды
2.2. Среды и антибиотики.
2.3. Выделение и идентификация молочнокислых бактерий.
2.4. Определение численности молочнокислых бактерий в пробиотическом препарате .
2.5. Определение антагонистической активности молочнокислых
бактерий
2.6. Определение титруемой кислотности молочнокислых бактерий
2.7. Определение устойчивости молочнокислых бактерий к поваренной
соли и желчи
2.8. Определение устойчивости молочнокислых бактерий к фенолу
2.9. Исследование биохимической активности молочнокислых бактерий
2 Определение спектра кислых метаболитов, образуемых бифидобактериями из глюкозы.
2 Выделение плазмидной ДНК из . i.
2 Выделение плазмидной ДНК из лактобацилл и энтерококков
2 Трансформация . i плазмидной ДНК
2 Манипуляции с ДНК.
2 Процедура скрещивания.
2 Определение порога устойчивости к действию антибиотиков
2 Определение сегрегационной стабильности плазмид
2 Индукция мутаций под действием нитрозогуанидинз.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ п ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение, идентификация и изучение некоторых биологических свойств лактобапилл из кишечника пушных ззерей
3.1.1. Выделение штаммов молочнокислых бактерий из содержимого
желудочнокишечного тракта пушных зверей
3.1.2. Исследование биологических признаков выделенных штаммов лактобацилл
. 3.1.2.1. Исследование клеточной морфологии, окраски по Граму,
формы колоний и определение наличия кзталазы.
3.1.2.2. Определение способности к росту при различных температурах
3.1.2.3. Определение видовой принадлежности исследуемых штаммов лактобацилл на основании их способности образовывать кислоты из различных углеводов.
3.1.3. Исследование физиологических и культуральных признаков выделенных штаммов лактобацилл.
3.1.3.1. Определение титруемой кислотности.
3.1.3.2. Определение чувствительности устойчивости к различным концентрациям фенола.поваренной соли и желчи
3.1.3.3. Определение антагонистической активности исследуемых штаммов лзктобадилл
3.1.3.4. Определение чувствительности устойчивости к антибиотикам исследуемых штаммов лактобацилл
3.1.3.5. Изучение роста исследуемых штаммов лактобацилл при культивировании их в ферментере
3.1.3. б. Определение ксероустойчивости
3.1.4. Характеристика штамма ЬассоЬзсШиз асасюрпПиэ ЗП7
3.2. Разработка, производство и испытания нового пробиотического препарата, на основе штамма ЬасЬоЬасШиБ асааорЫ
1из ЗП7 ВКШ Б
3.2.1. Обоснование потребности разработки нового пробиотического препарата.
V4 .
3.2.2. Описание технологического процесса производства и харак
I
3.3.1 3.3. а
3.3.
з. , 5 3.4.
3.4.
3.4.
3.4.
териотика Знтерацида П
Испытание опытной партии Знтерацида П.
Выделение, идентификация и изучение некоторых биологических свойств бифидобактерий из кишечника человека. .
Разработка новых сред для выделения и культивирования
бифидобактерий.
Определение видовой принадлежности изолятов бифидобактерии на основании их способности образовывать кислоты из
различных углеводов.
Чувствительность изолятов бифидобактерии к антибиотикам
Образование изолятами бифидобактерий муравьиной и уксусной кислоты из глюкозы
Антагонистическая активность супернатантов культуральных
жидкостей бифидобактерий.
Получение штаммов молочнокислых бактерий, устойчивых к
антибиотикам.
Безопасность мобилизуемых векторов семейства рЬР
Оптимизация процесса конъюгативной мобилизации в клетки
молочнокислых бактерий
.1. Определение эффективности двойных и тройных конъ
югационных скрещиваний.
.2. Увеличение эффективности переноса плазмид в клетки молочнокислых бактерий за счет использования мембранных фильтров. .
.3. Подбор оптимальной неселективной питательной среды для
совместного выращивания донорных и реципиентных клеток.
.4.Варьирование соотношения донорреципиент .
.5. Оптимизация времени совместного инкубирования донорных ц
реципиентных клеток.
3.4.3. Конъюгативная мобилизация плазмиды 2 в клетки молочнокислых бактерий
3.4.3.1. Изучение структурной стабильности плазмиды в клетках молочнокислых бактерий,
3.4.3.2. Изучение сегрегационной стабильности плазмиды в клетках молочнокислых бактерий.
3.4.3.3. Определение порога устойчивости молочнокислых бактерий, несущих плазмиду . к хлорамфениколу
3.4.4. Конъюгационнзя мобилизация плазмид, несущих ген Ьлакта
мазы в клетки молочнокислых бактерий
3.4.4.1. Конъюгативная мобилизация плазмиды в клетки молочнокислых бактерий
3.4.4.2. Конструирование плззмидного вектора .
3.4.4.3. Конъюгативная мобилизация плазмиды 5 в клетки молочнокислых бактерий.
3.5. клонирование гена соматолиберина в молочнокислых бактериях .
3.5.1. Клонирование гена соматолиберина в клетках Е.
3.5.2. Клонирование гена соматолиберина в молочнокислых бактериях и экспрессия пептида в системе грамположительных бактерий.
Заключение. 1с
ВЬВОДЫ
ОПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


С помощью генноинженерных методов получены штаммы молочнокислых бактерий компонентов пробиотиков, устойчивые к хлорамфениколу и беталактамным антибиотикам, а также штаммы, несущие ген соматолиберина. Глава 1. В последние годы многие научные положения, касающиеся состава и функций микрофлоры человека и животных, подверглись существенному пересмотру. Накоплены научные знания, позволяющие рассматривать микрофлору пищеварительного тракта, сельскохозяйственных животных как важнейшую экосистему, нормальное функционирование которой поддерживает их гомеостаз. Поэтому, любое нарушение микробиоценоза пищеварительного тракта приводит к нарушению фушщий рззличных систем организма. Большое значение для понимания роли нормальной микрофлоры принадлежит внедрению в практику исследований современной техники культивирования облигатно анаэробных микроорганизмов. В утробе плод, как правило, стерилен, но, проходя через родовые пути, он приобретает от матери множество рззличных микроорганизмов, количество которых быстро увеличивается. После рождения в пищеварительный тракт новорожденного попадает микрофлора, спе1дифичная для взрослого, который во многих случаях является носителем гнилостных, условнопатогенных и патогенных микроорганизмов. У животных это часто приводит к гибели молодняка разного возраста 3. Постепенно Формируется характерный для определенных биотопов организма микробный пейзаж1 . Известно, что для полостей организма человека и животных различных возрастных групп характерна определенная обли
гатная микрофлора, выполняющая важные для хозяина функции С9. Установлено, что симбионтные микроорганизмы синтезируют вещества. Б кишечнике с помощью ферментов микробиологического происхождения происходит расщепление питательных веществ ГЛ . Благодаря ферментативной активности амилолитической, протеолитической. Полифосфаты бактерий участвуют в переносе сахзров в клетку через, мембрану, выполняя функцию гексокинзз . Экспериментально установлен синтез каротина микрофлорой в анаэробных условиях пищеварительного тракта животных и возможность приживления каротинсинтезирующих культур в пищеварительном тракте животных, что открывает принципиально нозые пути решения проблемы обеспечения организма каротином 3. Экспериментальные данные отечественных и зарубежных исследователей указывают на значительную роль микрофлоры желудочнокишечного тракта свиней в биосинтезе витаминов группы Б. Б то же время кишечная микрофлора может отрицательно влиять на витаминный баланс организмахозяина, что имеет место при интенсивном размножении в кишечнике микроорганизмов, потребляющих или разлагающих их 3. Участие симбионтных микроорганизмов в азотистом белковом питании является одной из осноеных функций. Б результате сложных биохимических процессов, протекающих в желудочнокишечном тракте хозяина, микроорганизмы, усваивая поступающие питательные вещества, размножаются, растут и быстро увеличивают свою биомассу. Отмирая, они перевариваются и усваиваются организмом, являясь источником белка. Резидентная микрофлора увеличивает неспецифическую резистентность организмахозяина к инфекционным заболеваниям. Молочнокислые бактерии симбионты человека и животных способны колонизировать эпителий кишечника, т. Это определяется специфическими. Повидимому, адгезины определяют специфичность штаммов молочнокислых бактерий в отношении их свойства размножаться на поверхности эпителия определенных видов млекопитающих С3. Широкое применение в практике кормления сельскохозяйственных животных получили продукты микробного синтеза антибиотики, аминокислоты. Однако, нерациональное использование антибиотиков может привести к отрицательному результату С9, , , , 3. Известно, что достаточно долгое применение антибактериальных препаратов для лечения и профилактики заболеваний, а также для стимуляции роста животных приводит к снижению их благотворного действия вследствие появления резистентных штаммов бактерий С. Поэтому, в последние годы исследования направлены на изыскание препаратов, не обладающих отрицательными эффектами, а также не вызывающих образование резистентных штаммов микроорганизмов к химиотерапевтическим веществам.