Механизмы нарушения систем транспорта кальция в нейронах мозга при действии глутамата

• Автор: Сторожевых, Татьяна Павловна
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 212 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

. Приготовление первичной культуры нейронов.

. Микроспектрофлуориметрические исследования.

. Измерение внутриклеточной концентрации ЛТФ и отношения

АТФЛДФ

. Определение выживаемости нейронов

. Изучение захвата Са2 в гранулярные клетки мозжечка

. Измерение выхода цитохрома с из митохондрий

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 2. ПРОНИЦАЕМОСТЬ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ Са2 РСа

В ПОКОЕ, ВО ВРЕМЯ И ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТА
Обзор литерату ры
а. Глутамат как метаболит и основной возбуждающий нейротрансмиттер ЦНС.
б. Нейротоксичность глутамата.
. Изменение 2 в нейронах мозжечка и гиппокампа крысы во время действия глутамата или гиперкалиевой деполяризации.
. Исследование динамики спектрофлуориметрическим методом.
. Исследование динамики Р радиоизотопным методом
Выводы
Глава 3. РОЛЬ Ха7Са2 ОБМЕНА ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ В
РЕГУЛЯЦИИ Са2 ГОМЕОСТАЗА НЕЙРОНОВ В 1I И ПОСЛЕ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТА ИЛИ КАЛИЕВОЙ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ
Обзор литерату ры.
. Влияние бепридила, как ингибитора обмена, на регуляцию
Са в нейронах в покое и во время действия глутамата
. Изменения Са2, в нейронах при блокаде обмена заменой
внеклеточного
. Изменения Са2, при блокаде V2 обмена путем замены в
инкубационной среде на .
. Влияние V2 обмена на регуляцию Са2 , в условиях блокады
захвата Са2 митохондриями и ретикулумом
. Влияние блокады 2i обмена на уровень 2 в нейронах во
время длительного действия или калиевой деполяризации.
Выводы.
Глава 4. РОЛЬ Са2АТФАЗЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ И
ЭНДОПЛАЗМА ГИЧЕСКО О РЕТИКУЛУМА В РЕГУЛЯЦИИ Са2 ГОМЕОСТАЗА НЕЙРОНОВ В ПОКОЕ И ПОСЛЕДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТА ИЛИ КАЛИЕВОЙ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ
Обзор литерату ры.
. Влияние ингибирования Са2 насоса плазмалеммы ортованадатом
на Са в нейронах в покое и после действия глутамата.
. Изменение Са2 в нейронах при ингибирования Са2 насоса
плазмалеммы внеклеточным защелачиванием
. Исследование роли Са2АТФазы в регуляции Са2, гомеостаза
нейронов путем замещения Са2 во внеклеточной среде на Ва .
. Роль зндоплазматического ретикулума в регуляции Са2 в нейронах в
покое и после стимуляции глутаматом.
Глава 5. ДИСФУНКЦИЯ МИТОХОНДРИЙ КЛЮЧЕВОЕ ЗВЕНО В МЕХАНИЗМЕ НАРУ ШЕНИЯ Са2 ГОМЕОСТАЗА НЕЙРОНОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ГЛУТАМАТА
Обзор литературы
. Влияние глутамата на потенциал внутренней митохондриальной мембраны. ДЧщ
. Влияние блокады захвата митохондриями на восстановление
базальной Са2 , после кратковременного действия глутамата.
. Блокада захвата Са2 митохондриями увеличивает 2 в нейронах во
время действия глутамата
. Деполяризация митохондрий основная причина дестабилизации
нейронального Са2, гомеостаза при длительном действии глутамата
. Внутриклеточное содержание АТФАДФ при действии и при
сочетанном действии и митохондриальных ингибиторов
. Возможность индукции поры в митохондриях культивируемых нейронов
мозжечка после действия глутамата.
Выводы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


У дневных крысят линии i извлекали мозжечки в соответствии с этическими требованиями по работе с животными анестезия Холодовым способом, промывали в бескатьцисвом и безмагниевом растворе Хенкса i, США, измельчали и помещали на мин в 0. ЭДТА ЗбС. После инкубации трипсин двукратно отмывали стандартным раствором Хенкса i, США с феноловым красным, а затем культуральной средой ii i i, i, США на растворе Игла, содержащей фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Затем клетки диспергировали в свежей среде МЕМ до получения однородной суспензии, которую центрифугировали 1 мин при обмин. Осажднные клетки рееуспендировали в соответствующем объме свежей МЕМ примерная концентрация А клетокмл и переносили мкл на находящиеся в чашках Петри покровные стерильные стекла размером x мм2, покрытые полиПлнзином мкгмл. М I. Для радиоизотоп пых исследований ресуспендированные клетки переносили непосредственно либо в чашки Петри диаметром мм. Клетки содержались в течение 7Ю дней в инкубаторе воздуха 5 СО, относительная влажность в среде МЕМ с добавлением мМ КС1. Присутствие мМ Кг необходимо для созревания нейронов, т. Кроме того, в условиях высокого К подавляется активность ферментов, определяющих развитие апоптоза ii . На сутки культивирования в среду инкубации во всех вариантах добавляли арабинозинмоноцитозид 0. М для предупреждения пролиферации не нейрональных клеток. Получали смешанную нейроглиальную культуру с подавляющим большинством зернистых клеток. Нейроны были легко отличимы от клеток глии они были контрастно очерчены, с большим ядром, имели гладкую округлую форму с отростками и лежали в фокальной плоскости над глией. Приготовление культуры гиппокампальных нейронов крыс. Гиппокампы извлекали из мозга дневных крысят, помещали в сбалансированный солевой раствор без магния и кальция , i. С в растворе, содержащем трипсин и ЭДТА. Полученную суспензию переносили на покровные сткла размером x мм2 1 гиппокамп в объеме 0 мкл среды на одно стекло, покрытые нолиОлизином. На следующий день в чашки добавляли но 1. Клетки помещали в инкубатор, где они находились без смены среды до 3 недель. Инсулин едмл 0. I люкоза 1. НейробазальнаяА среда с добавлением В по каталогу i мл. Хаспеков, . Микроспектрофлуириметри чес кие исследован и я. Перед экспериментом клетки загружали в культуральной среде соответствующим зондом для измерения 2. АЧут см. М 5, КС 5, СаС1 1. КН2Р 0. Затем стекло с клетками помещали в перфузионную камеру объм 0. Япония. Микроскоп был совмещен со спектрофлуориметром x, США. Спектрофлуориметр состоял из двух возбуждающих монохроматоров с дифференциальной решеткой, пропускающей необходимые длины волн, и зеркального механизма для разделения лучей чоппер. В этих случаях раствора доводили до 7. НС1 или i. Имидж, Диаморф, Россия при освещении попеременно двумя лучами света с разными длинами волн. Источником света служила ксеноновая лампа мощностью 0 Вт. Экспозиция фаза чоппера длилась 0, с, с интервалом темповая фаза в сек во избежание выгорания зонда. Интенсивность флуоресценции регистрировали, используя соответствующие для каждою зонда дихроичные зеркала и фильтры. Видеокамера . I Vi . Диаморф Россия позволяла получать цифровую запись эксперимента и ее обрабатывать. Для измерения ГСа, клетки загружали мин мкМ ацетоксимссильного эфира высокоаффинного зонда 2 с константой диссоциации 5 нМ i . М низкоаффинного зонда 2 с константой диссоциации 5 мкМ . Спектр флуоресценции этих липофильных зондов смещается к более коротким волнам при увеличении связывания молекул зонда с Са2 рис. Для возбуждения флуоресценции использовали волны длиной Асх 0 и 0 нм, для эмиссии фильтр, вырезающий 5 нм. В большинстве опы тов, оценивая изменения Са мы ограничились шкалой отношений или . Рзбо, и 0 интенсивности флуоресценции при освещении длинами волн 0, 0 и 0 нм соответственно изза неопределенности, возникающей при использовании разных калибровочных методик. При увеличении Са , отношение увеличивается рис. В тех случаях, когда приведена шкала V калибровку проводили согласно iii . Ка это константа диссоциации 5 нМ для 2 и 5 мкМ для 2.