Свойства и топография внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании

• Автор: Григорьев, Павел Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 122 с. : 17 ил.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

Цель и задачи исследования

Объект исследования

Методы исследования

Научная новизна полученных результатов.

Теоретическая значимость полученных результатов

Положения, выносимые на защиту.

Личный вклад соискателя

Внедрение результатов работы.

Сведения об апробации результатов диссертации

Структура диссертации, ее объем
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура нервномышечного синапса
1.1.1. ПреетI этическая область
IЛ. 1.1. Активные зоны
1Л.1.2. Синаптические везикулы
1Л .2. Постсинаптическая область.
1.2. Механизм секреции нейромедиатора
1.2.1. Квантововезикулярная гипотеза секреции медиатора
1.2.2. Работа активной зоны и везикулярные пулы.
1.2.2.1. Докирование везикул
1.2.2.3. Механизмы секреции медиатора, значение ЛАКЕкомплекса 1.2.2.4 Прссинаитические кальциевые сигналы. Гипотеза кальциевых микро и макродоменов
1.3. Механизмы эндоцитоза синаптических везикул
1.3.1. Функционирование клатринового покрытия
1.3.2 Молекулярная машина эндоцитоза
1.3.2. Связывание клатрина с мембраной
1.3.3. Отделение везикулы от пресииаптической мембраны
1.3.4. Освобождение поверхности везикулы от клатринового покрытия.
1.3.5. Постэндоцитозный везикулярный транспорт
1.3.6. Кинетика эндоцитоза
1.3.7. Регуляция эндоцитоза.
1.3.8. Время везикулярного цикла
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Объект исследования и растворы.
2.2. Электрофизиология .
2.2.1. Внутриклеточная регистрация, миниатюрных потенциалов концевой пластинки, токов концевой пластинки и мембранного потенциала.
2.2.2. Внеклеточная регистрация миниатюрных токов концевой пластинки и токов концевой пластинки
2.2.3. Количественная оценка квантового состава при длительном высокочастотном раздражении в растворах с ионами Са и Бг, а также при использовании ВАРТААМ и ЕвТААМ
2.2.4. Количественная оценка асинхронной квантовой секреции медиатора при высокочастотном раздражении в растворах с ионами Ва
2.3. Оптический метод исследования экзоэндоцитозного цикла с использованием маркера РМ
2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Оценка значения ионов Са в обеспечении сохранения соотношения процессов экзо и эндоцитоза при различных способах стимуляции секреции медиатора.
3.1.1. Влияние калиевой деполяризации на спонтанную секрецию медиатора
3.1.2. Влияние деполяризации мембраны постоянным током на спонтанную секрецию медиатора.
3.1.3. Спонтанная секреция медиатора при действии кофеина.
3.1.4. Спонтанная секреция медиатора при экспозиции гиперосмотических растворов.
3.1.5. Вызванная синхронная секреция медиатора в процессе высокочастотного раздражения
3.1.6. Влияние калиевой деполяризации на процессы экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул
3.1.7. Влияние деполяризации мембраны постоянным током на процессы экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул
3.1.8. Экзо и эндоцитоз синаптических везикул при действии кофеина
3.1.9. Эндоцитоз синаптических везикул при экспозиции гиперосмотических растворов.
3.1 Эндоцитоз и экзоцитоз синаптических везикул при высокочастотном раздражении.
3.1 Эндоцитоз и экзоцитоз синаптических везикул в условиях блокады потенциалзависимых кальциевых каналов ионами Сс1. Вход ионов Са как фактор, обеспечивающий сохранение соотношения процессов экзо и эндоцитоза
3.2. Оценка топографии внутриклеточных кальцийсвязывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул.
3.2.1. Влияние внутриклеточных Сабуферов ЕСТАЛМ и ВАРТААМ на спонтанную секрецию медиатора при действии гиперкалиевого раствора и фазную секрецию медиатора при высокочастотной ритмической активности .
3.2.2. Внутриклеточные Сабуферы ЕСТААМ и ВАРТААМ и процессы экзоцитоза синаптических везикул.
3.2.3. Внутриклеточные Сабуферы ЕвТААМ и ВАРТААМ и процессы эндоцитоза синаптических везикул. Топография кальцийсвязывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул
3.3. Оценка чувствительности внутриклеточных кальцийсвязывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул к катионам Са , Бг, Ва и .
3.3.1. Ионы Са , Бг, Ва и одинаково стимулируют асинхронную, спонтанную секрецию медиатора при действии гиперкалиевого раствора
3.3.2. Ионы Са и Бг, но не М поддерживают синхронную секрецию медиатора при высокочастотной ритмической активности
3.3.3. Ионы Ва не поддерживают синхронную, но стимулируют асшгхронную секрецию медиатора при высокочастотном раздражении
3.3.4. Ионы Са, Бг, Ва и стимулируют полный экзоцитоз синаптических везикул.
3.3.5. Ионы Са и Ва одинаково эффективны в стимуляции эндоцитоза синаптических везикул. Ионы Бг менее эффективны, а ионы не поддерживают эндоцитоз при стимуляции везикулярною цикла гиперкалиевым раствором.
3.3.6. Ионы Са и Ва одинаково эффективны в стимуляции эндоцитоза синаптических везикул. Ионы Бг менее эффективны, а ионы не поддерживают эндоцитоз при стимуляции везикулярного цикла в ы соко астоп 1 ым раз дражен ием
3.3.7. Экзоцитоз и эндоцитоз синаптических везикул 1 растворах с ионами щелочноземельных металлов. Возможные кандидаты на роль Сасвязывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул
ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Многочисленные исследования показали, что в процессах слияния везикул и секреции медиатора задействованы разные Сасвязываюшие сайты экзоцитоза, отличающиеся по локализации, афинности к ионам Са и другим катионам щелочноземельных металлов 8г, Ва. Активация этих сайтов лежит в основе различных видов секреции медиатора 1 вызванной фазной связанной с возникновением пресинапгического потенциала действия ПД и 2 спонтанной возникающей в отсутствии ПД 4 4. Топографию и афииность сайтов экзоцитоза удобно описывать двумя основными моделями. Модель Самикродомена предлагает расположение низкоаффинного сайта экзоцитоза в непосредственной близости от Саканала десятки нм, который активируется короткоживущим облаком повышенной сотни мкМ концентрации кальция при открытии канала. Модель макродомена предполагает наличие высокоаффинного сайта на более удаленном расстоянии согни нм от Саканала. В этом случае активация экзоцитоза происходит при концентрации Са менее мкМ, и связана с открытием нескольких множества близкорасположенных каналов 3 4. Определить, по какой из моделей осуществляется активация сайта Самикродоменом или Са макродоменом, позволяет использование быстрых и медленных внутриклеточных Сахелаторов 3. Значение ионов Са в процессах эндоцитоза не столь очевидно, выявлена как их инициирующая, так и ингибирующая роль в процессах рециклирования везикул 2 , и в то же время оспаривается необходимость участия ионов Са в данных процессах 1. Топография и свойства Сасвязывающих сайтов эндоцитоза не определены. Ключевая роль процессов экзоцитоза и эндоцитоза в синаптических механизмах, недостаточность наших знаний о значении ионов Са в запуске, регуляции и поддержании соотношения процессов экзоцитоза и эндоцитоза, диктуют необходимость исследования расположения относительно Саканалов пресинаптической мембраны и чувствительности к двухвалентным катионам Сасвязывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза СВ. Цслыо данного исследования явилось изучение соотношения процессов экзо и эндоцитоза СВ при различных способах стимуляции экзоцитоза, а также определение топографии и чувствительности Сасвязывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза СВ к ионам Са, Бг, Ва и в двигательном нервном окончании лягушки. Для оценки свойств Сасвязывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул исследовать загрузку и выгрузку красителя РМ 1 при замене внеклеточных ионов Са на ионы Яг, Ва, 1. Эксперименты проводились на нервномышечных препаратах кожногрудинной мышцы лягушки Капа КлсШшпйа в летнеосенний период августноябрь месяцы. Использовано 0 лягушек. РМ 1 для обработки полученных результатов использовались математический анализ и статистический метод. Впервые показана активация Сасвязывающсго сайта спонтанной секреции не только ионами Са, Яг, Ва, но и ионами М. Впервые показано, что в двигательном нервном окончании лягушки экзоцитоз СВ может происходить по типу к1я8апс1гип. В работе получены данные, предполагающие наличие внутриклеточного Сасвязывающего сайта эндоцитоза СВ в двигательном нервном окончании лягушки. Сасвязывающего сайта эндоцитоза при спонтанной и вызванной секреции медиатора осуществляется в области Самикродомена, и данный сайт в нервном окончании обладает чувствительностью к ионам Ва и Бг. Сасвязывающие сайты экзоцитоза и эндоцитоза СВ отличаются по топографии и свойствам. Проведенное исследование имеет важное теоретическое значение. Работа позволяет более детально определить функционал,иые возможности химического синапса. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о механизмах, участвующих в осуществлении передачи информации между возбудимыми клетками. Более глубокое понимание механизмов, обеспечивающих процессы экзоцитоза и эндоцитоза, может быть использовано при объяснении процессов, происходящих в центральной нервной системе и лежащих в основе памяти, эмоций, поведения, научения и т. Учитывая тот факт, что механизмы эндоцитоза являются универсальными для всех видов клеток, результаты работы могут помочь в выяснении механизмов и поиска новых фармакологических препаратов, регулирующих также процессы фагоцитоза и пиноцитоза. В целом, изложенные экспериментальные данные расширяют представления о механизмах передачи информации в химическом синапсе.