Механизмы выключения каскада фототрансдукции и световая адаптация в палочках лягушки

• Автор: Астахова, Любовь Александровна
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 113 с. : ил.

1.1. Структура фоторецепторов

Г.2.Механизм фототрансдукции

1.3. Усиление сигнала в каскаде фототрансдукции.

1.4.Механизмы выключения каскада фототрансдукции

1.5. Общие представления о световой адаптации фоторецепторов

1.6. Роль кальция в световой адаптации

1.7. Обмен кальция между наружным сегментом фоторсцепора и окружающей средой в темноте и на свету
1.8. Мишени, на которые влияет изменение концентрации кальция в наружном сегменте фоторецептора

1.9. Феномен световой адаптации фоторецепторов

1 Поиск дополнительных механизмов регуляции фототрансдукции.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Экспериментальный материал.
2.2. Экспериментальная установка
2.3. Изготовление микропипсток
2.4.Поиск и фиксация одиночных палочек в микропипетке.
2.5.Система световой стимуляции
2.6. Программа для управления стимуляцией и записи ответов
2.7.Первичная обработка результатов.
2.8.Система быстрой смены омывающего раствора.
2 Методика кальциевого клампа. Состав растворов.
2 Метод вычисления временного хода активности ФДЭ из нормированного клампированного ответа
2 Измерение темповой активности фосфодиэстеразы.
Глава 3. Результаты.
3.1. Измерение темновой активности ФДЭ
3.2.Проверка качества фиксации внутриклеточной концентрации кальция.
3.3.Исследование временного хода свстоиидуцированной активности ФДЭ.
3.3.1 Протокол эксперимента
3.3.2. Выбор значения кооперативное каналов для расчетов
3.3.3. Анализ кривых свстоиидуцированной активности ФДЭ в темновых условиях в отсутствии фоновых засветок
3.3.4 Особенности экспериментальной процедуры и вычислений при извлечении кривых активности ФДЭ в условиях световой адаптации при фоновых засветках
3.3.5 Анализ кривых активности ФДЭ в условиях световой адаптации при фоновых засветках.
3.4. Измерение критической постоянной времени выключения каскада то.
3.4.1 Критическая постоянная времени выключения каскада то в темновых условиях
3.4.2 Анализ кривых Пепперберга и критической постоянной времени то в условиях
фоновых засветок .
3.5. Независимость коэффициента усиления от световой адаптации.
Глава 4. Обсуждение.
4.1 Эффективность клампирования внутриклеточной концентрации кальция.
4.2 Ускорение инактивации родопсина и выключения трансдуцина при световой адаптации.
4.3 Критическая постоянная времени тр не соответствует ни фосфорилированию родопсина, ни инактивации трансдуцина в палочках лягушки
4.4 Ускорение инактивации трансдуцина и снижение чувствительности при фоновых засветках.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Фактором, который затрудняет измерение этих параметров в живой фоторецепторной клетке, является наличие отрицательных обратных кальциевых связей, которые жестко регулируют скорость выключения основных участников каскада. В данной работе была применена методика так называемого кальциевого клампа т. А кривая светоиндуцированной активности ФДЭ в свою очередь определяется кинетикой выключения родопсина и трансдуцина. При помощи метода кальциевого клампа оценить параметры кривых активности ФДЭ в палочках лягушки при подаче ненасыщающих световых стимулов в отсутствии кальциевых обратных связей. Выяснить, каким образом влияет световая адаптация и сопряженные с ней изменения внутриклеточного уровня кальция на скорости инактивации родопсина и трансдуцина. Определить, какой из процессов инактивации каскада является лимитирующим для скорости выключения фотоответа палочек лягушки на насыщающие световые стимулы. В данной работе нами впервые исследована скорость активации и инактивации светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы в интактных палочках лягушки в условиях темновой и световой адаптации. Показано, что световая адаптация в палочках лягушки ускоряет не только выключение родопсина, но и инактивацию трансдуцина. При интенсивных фоновых засветках такое ускорение каждого из процессов выключения может быть более чем шестикратным. Этот результат заставляет пересмотреть существующие до сих пор представления о том, что выключение трансдуцина не зависит от внутриклеточной концентрации кальция и световой адаптации. Скорость инактивации трансдуцина, как и скорость фосфорилирования родопсина, находится под контролем световой адаптации. При интенсивных фоновых засветках оба этих процесса могут ускоряться более чем в 6 раз. Величина ускорения обоих процессов выключения каскада фототрансдукции позволяет полностью объяснить уменьшение чувствительности, наблюдаемое при интенсивных фоновых засветках. Ни фосфорилирование родопсина, ни инактивация трансдуцина не лимитируют скорость выключения фотоответа на насыщающие стимулы в палочках лягушки. Процесс, лимитирующий скорость выключения насыщенных фотоответов, может быть гипотетически отождествлен со связыванием родопсина с аррестином. Подробное исследование кинетики процессов выключения каскада позволило углубить наше понимание молекулярных механизмов фототрансдукции в темновых и светоадаптированных условиях. Выявленные закономерности могут оказаться полезными и для понимания работы других сигнальных каскадов, которые изучены в меньшей степени, чем каскад фототрансдукции. XX Съезде физиологического общества им. Международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация Пущино, . VI Европейском Форуме по Нейробиологии Женева, . По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях и 1 статья в ii. Глава 1. Обзор литературных данных. Фоторецепторные клетки позвоночных палочки и колбочки служат для восприятия квантов света в них происходит преобразование световой информации в электрический сигнал. Процесс такого преобразования носит название фототрансдукции. В настоящее время детально изучены ключевые этапы механизма фототрансдукции. Он представляет собой многоступенчатый каскад реакций, итогом работы которого является снижение концентрации циклического гуанозинмонофосфата цГМФ и закрытие катионных каналов. Квант света поглощается молекулой зрительного пигмента родопсина, что приводит к ее возбуждению. Возбужденный родопсин взаимодействует с Обелком трансдуцином. Далее активированный трансдуцин связывается с фосфодиэстеразой ФДЭ. В темноте активность ФДЭ заингибирована, а при активации трансдуцином ее гидролитическая активность значительно повышается, происходит массовый гидролиз цГМФ, и его концентрация в наружном сегменте падает. Это приводит к закрытию цГМФчувствительных мембранных катионных каналов, вследствие чего мембрана клетки гиперполяризуется. Именно этот гиперполяризационный электрический потенциал и представляет собой тот сигнал, который фоторецепторная клетка передает через синапс к биполярным и горизонтальным нервным клеткам. Структура Фоторецепторов. Нес ИЛУ, .