Выявление и анализ активного механизма импорта ДНК в растительные митохондрии

• Автор: Кулинченко, Милана Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Страсбург - Иркутск
• Количество страниц: 144 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ а

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общая характеристика митохондриального генома высших

РАСТЕНИЙ.

1.1.1 Особенности структурной организации генома растительных митохондрий

1.1.2 Кодирующие последовательности мтгенома высших растений.

1.1.3 Перенос нуклеотидных последовательностей между органеллами

1.2 Плазмидоподобные митохондриальные ДНК высших растений

1.2.1 Исследования репликации ппДНК

1.2.2 Функциональная роль ппДНК в растительных митохондриях
1.2.3 Происхождение ппДНК
1.3 Исследования импорта нуклеиновых кислот в митохондрии
1.3.1 Роль импорта нуклеиновых кислот в реализации генетические
процессов в митохондриях на примере импорта РНК
1.3.2. Исследование механизмов импорта тРНК у различных организмов
1.3.2.1 Участие митохондриального белкового аппарата импорта в транслокации РНК у Зассаготусеэ сегеу1зае и млекопитающих.
1.3.2.2 Прямой импорт тРНК у трипаносоматид
1.3.2.3 Исследования механизма импорта РНК у растений
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Выделение растительных митохондрий.
2.2 Функциональное тестирование изолированных растительных митохондрий
2.3 Молекулярнобиологические методы, использованные при анализе ДНК и клонировании генетических конструкций для импорта
2.3.1 Амплификация ДНК в полимеразной цепной реакции ПЦР.
2.3.2 Трансформация бактерий методом электропорации
2.3.3 Выделение плазмидной ДНК и ее ферментативная обработка.
2.3.4 Электрофоретический анализ ДНК и элюцияДНК из агарозного геля.
2.4 Радиоактивно мече 1ые субстраты ДНК, использованные для импорта в митохондрии
2.5 Создание генетических конструкций для импорта ДНК в МИТОХО 1ДРИИ и транскрипции.
2.6 Эксперименты по импорту ДНК в митохондрии
2.6.1 Импорт ДНК в изолированные митохондрии в стандартных условиях.
2.6.2 Получение митопластов
2.6.3 Обработка митохондрий окислительными агентами
2.6.4 Обработка митохондрий трипсином
2.6.5 Обработка митохондрий антителами.
2.7 Анализ транскрипции импортированных в митохондрии
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИПЦР
2.8 Анализ транскрипции и репликации импортированных в
митохондрии ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК МЕТОДОМ СИНТЕЗА РНК и ДНК I.
2.9 Получение субмитохондриальных фракций.
2. Электрофорез митохондриальных белков в полиакриламидном геле ПААГ и радиоавтография геля
2. и блоттинг.
2. Транскрипция i vi
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Транслокация ДНК В РАСТИТЕЛЬНЫЕ митохондрии.
3.1.1 Определение условий импорта ДНК в растительные митохондрии .
3.1.2 Импорт ДНК происходит через интактные внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны.
3.2 Определение специфичности импортируемой в растительные митохондрии ДНК.
3.3 Транскрипция и репликация импортируемой в митохондрии ДНК
3.3.1 Клонирование векторов для анализа экспрессии импортированной в растительные митохондрии экзогенной ДНК
3.3.2 Анализ транскрипции импортированной в митохондрии экзогенной ДНК методами ОТПЦР и блот гибридизации.
3.3.3 Анализ репликации импортированной в растительные митохондрии экзогенной ДНК методом блот гибридизации
3.4 Исследование механизма импорта ДНК в растительные митохондрии.
3.4.1 Активность процесса транслокации ДНК.
3.4.2 Исследование участия в процессе импорта ДНК митохондриальных белков методами блот гибридизации и ковалентных сшивок
3.4.3 Импорт ДНК в митохондрии и явление митохондриальной мегапроницаемости.
3.4.4 Исследование участия в процессе транслокации ДНК митохондриального порина
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ в
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Посредством аэробного дыхания митохондрии обеспечивают клетку энергией, в виде АТФ, однако, помимо этой важной функции митохондрии вовлечены и в другие клеточные процессы у высших организмов, включая процессы апоптоза и старения. Между митохондриями животных, растений, грибов и простейших существуют глубокие различия, связанные с размерами митохондриальных геномов, их организацией, количеством содержащихся в них генов и их экспрессией . Митохондриальный геном животных компактен тпн, характеризуется измененным кодом ДНК, нестандартной структурой тРНК и включает в себя 5 генов, которые не содержат интронов i, . Митохондриальный геном грибов составляют линейные молекулы с размерами 8 тпн vi III, . Простейшие представляют собой группу, эволюционно весьма разнообразную по сравнению с остальными эукариотами, и их митохондриальный геном отличается, соответственно, таким же разнообразием своей структуры. Среди них следует отметить геном пресноводного зоофлагелята i i размером тпн, содержащий по меньшей мере кодирующих белки гена, сохраняющий универсальный код и характеризующийся некоторыми эубактериальными чертами . Размеры митохондриальной ДНК у исследованных видов растений варьируют от 0 до тысяч пар нуклеотидов тпн, при этом кратные различия в размерах митохондриальных ДНК растений обнаруживаются даже в пределах одного семейства, например у тыквенных i . Тем не менее, анализ кинетики ренатурации показал, что мтДНК высших растений содержат, в основном, уникальные последовательности, которые составляют до генома vi, . У высших растений в составе мтгенома с помощью электронной микроскопии было показано наличие гетерогенных по размерам популяций кольцевых, а также линейных молекул ДНК. Были обнаружены значительные вариации размеров и соотношения различных классов кольцевых молекул у разных видов растений и , , . К середине х годов большинство исследователей сходилось во мнении, что в составе генома митохондрий высших растений имеется гигантская кольцевая молекула, называемая основной хромосомой или мастерхромосомой, которая несет большую часть геномной информации. Наличие в составе основной кольцевой мтДНК прямых и инвертированных повторов, размером от 6 до тпн, обеспечивает внутри и межмолекулярные рекомбинации, что приводит к возникновению в митохондриальном компартменте гетерогенной популяции субгеномных молекул ДНК, находящихся в динамическом равновесии как между собой, так и с основной хромосомой , i и , i и , и , . Имеются повторы двух видов повторы, которые вовлечены в процесс рекомбинации и те, которые в этом не участвуют. Повторы второго типа неактивны, но в случае, когда происходит рекомбинации, в них образуются мутации. В каждом из , и цмс мтгеномов кукурузы имеется пять повторов рекомбинации, создающих сложную гетерогенную и в некотором роде повторяющуюся геномную организацию, называемую мультикомпонентной структурой , . У ii было показано, что два больших повтора, размером 6,5 и 4,2 тпн, участвуют в рекомбинационных процессах, приводящих к образованию субгеномных кольцевых молекул i i, . Помимо гетерогенного набора кольцевых молекул ДНК, связанных между собой рекомбинационными процессами, митохондриальный геном многих видов высших растений содержит небольшие, кольцевые или линейные, автономно реплицирующиеся молекулы ДНК или РНК, размером от 1 до тпн. Подробнее о митохондриальных плазмидоподобных ДНК будет рассказано в следующем разделе. Переход от раннего периода исследования физического устройства мтгенома растений к настоящему времени может быть отмечен с начала использования пульсэлектрофореза англ. ДНК. При проведении наблюдались три основные фракции молекул мтДНК фракция подвижных молекул приблизительно 0 тпн фракция молекул в зоне компрессии фракция молекул, не входящих в гель и остающихся в карманах нанесения i и i, i, . При этом приблизительно всей митохондриальной ДНК, определяемой по окрашиванию бромистым этидием или мечением Н3тимидином, находится в последней фракции. Как было установлено, около фракции молекул 0 тпн являются линейными. Зона компрессии содержит как кольцевые, так и очень длинные от нескольких сотен тпн до более чем тпн линейные молекулы.