Мембранный механизм действия ауксина на растительные клетки

• Автор: Шишова, Мария Федоровна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 290 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рецепция ауксинового сигнала

1.1.1. Ауксинсвязывающие белки растительных клеток

1.1.2. Строение ауксинсвязывающего белка 1.

1.1.3. Участие АСБ1 е ауксинзависимых реакциях

1.1.4. Предполагаемый механизм локализации АСБ1 в плазмалемме растительных клеток

1.1.5. Модели рецепторного комплекса ауксина плазмалеммы

1.2. Системы вторичных посредников, принимающих участие в передаче ауксинового сигнала.
Действие ауксина на НАТФазу плазмалеммы
1.3. Роль ионов кальция в трансдукции ауксинового сигнала.
1.4. Влияние ауксина на мембранный потенциал растительных клеток
1.5. Действие ауксина на пассивный транспорт ионов через плазмалемму
1.5.1. Системы К транспорта плазмалеммы и их
регуляция ауксином
1.5.2. Анионные каналы плазмалеммы и их регуляция ауксином.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Выращивание проростков кукурузы.
2.1.2. Выращивание проростков пшеницы
2.1.3. Выращивание растений арабидопсиса.
2.2. Методы
2.2.1. Измерение разности биоэлектрических потенциалов между концами отрезка различных органов
проростка кукурузы
2.2.2. Определение концентрации ионов К, Са2 и СГ в
инкубационной среде с помощью ионселективных электродов.
2.2.3. Определение рост активирующей способности
ауксина в различных органах проростка кукурузы
2.2.4. Определение эндогенного содержания свободной ИУК
в различных органах проростка кукурузы.
2.2.5. Определение интенсивности полярного транспорта
СИУК в различных органах проростка кукурузы
2.2.6. Выделение протопластов из клеток листьев
пшеницы и арабидопсиса.
2.2.7. Определение величины мембранного потенциала
протопластов листьев пшеницы.
2.2.8. Определение цитоплазмы клеток листьев
пшеницы и арабидопсиса.
2.2.9. Определение концентрации Са2 в цитоплазме протопластов из листьев пшеницы
2.2 Получение везикулярной фракции плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы.
Оценка ориентации везикул и их проницаемости
2.2 Определение генерации электрохимического градиента ионов на мембране везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы
2 Определение величины мембранного потенциала
на мембранах везикул
2 Определение величины внутри везикул плазмалеммы плеток колеоптилей кукурузы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изменение биоэлетрического потенциала отрезка колеоптиля кукурузы как отражение механизма
действия ауксина на растительные клетки.
3.2. ИУКиндуцированная первичная негативация биоэлектрического потенциала
3.3. Ауксинзависимая динамика содержания ионов Са2 и Н
в цитоплазме протопластов из клеток листьев пшеницы
3.3.1. Ауксининдуцированное закисление цитоплазмы
протопластов из клеток листьев пшеницы
3.3.2. Ауксинзависимая динамика концентрации ионов Са
в цитоплазме
3.4. Изучение прямого действия ауксина на транспортную функцию НАТФазы плазмалеммы.
3.5. Изучение действия ауксина на пассивный транспорт ионов Са2 через плазмалемму клеток колеоптилей кукурузы
3.6. Механизм регуляции ауксином Са2 каналов плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Когда последовательность в белке была заменена на не работающую как сигнал возврата в ЭР, присутствие АСБ1 отмечалось на ПМ и в культуральной среде клеток насекомых . Следует подчеркнуть, что АСБ1 стабилен в ЭР, тогда как в условиях, соответствующих клеточной стенке, он гораздо менее стабилен. Возможно, это обеспечивает быстрый обмен активного пула белка и столь большие трудности в определении поверхностной локализации АСБ1 iv . В этом случае функция локализованного в ЭР белка заключается в обеспечении быстрых изменений его содержания на поверхности клетки в ответ на различные сигналы посредством увеличения экспорта. Предполагалось , , что АСЫ может перемещаться между ЭР и ПМ и связывать ауксин как внутри, так и снаружи клетки. Конформационные изменения, имеющие место при связывании ауксина, могут скрыть сигнальную последовательность не только от моноклональных антител, но и от механизмов возврата в ЭР. Однако, чувствительность АСБ1 к ауксину очень низка при нейтральных , свойственных просвету эндоплазматического ретикулума. ЭР высоких концентраций ИУК и связывание азидоИУК в этом компартменте не наблюдается. Кроме того, обработка ауксином клеток млекопитающих, экспрессирующих АСБ1, не приводила к экскреции белка. Вполне вероятно, что пул АСБ1 на плазмалемме появляется в результате слабой неспецифичной утечки из ЭР, которую можно обнаружить путем иммобилизации белков в результате взаимодействия с якорным белком. Нельзя исключить также возможности взаимодействия АСБ1 с якорным белком непосредственно внутри ЭР и экспорта вместе с ним, подобно тому, что было зарегистрировано для рецепторассоциированного белка животных клеток , . АСБ1 на плазмалемме в отсутствии ауксина, повидимому, свидетельствует о том, что белок находится в ассоциированном состоянии с его якорным белком, т. АСБ1, а затем с трансмембранным доменом. АСЫ означает, что на протопластах присутствуют свободные, то есть не задействованные в рецепторных комплексах якорные белки. Модель двухкомпонентного строения рецептора ауксина, аналогичного рецепторам животных, была предложена в , . Она предполагала последовательное взаимодействие ауксина с АСБ1, а затем, при изменении конформации с трансмембранным доменом, активизация которого и вызывает ответ клетки на гормональное воздействие. Доказательства в пользу этой модели получены из исследований гормональной регуляции Кканалов, проведенных с использованием замыкающих клеток устьиц Vii . Кканал внутреннего выпрямления этих клеток отвечает на действие ауксина двойственным образом. Низкие концентрации гормона 0,1 мкМ стимулируют поток, а высокие более мкМ ингибируют , i, . АСБ1, которые могут взаимодействовать с гипотетическим якорным белком, могли сами вызывать физиологический ответ. Авторы тестировали пептиды, представляющие собой предполагаемые поверхностные домены АСБ1. Эффект был полностью обратим, и концентрация пептида, дающая максимального ответа составляла мкМ. Пептид, состоящий из тех же аминокислот, но в другом порядке, был неактивен. Ингибирование Гпотока внутреннего выпрямления блокировалось забуфериванием цитоплазмы бутиратом. Эффект, повидимому, опосредован изменениями цитоплазматического , а не контролируется прямым взаимодействием АСБ1 и канала. Показано также, что этот пептид вызывает заметное подщелачивание цитоплазмы. Таким образом, АСЫ на внешней поверхности клетки может взаимодействовать с компонентом цепи передачи сигнала посредством Сконцевого домена. Однако указанный пептид не имитирует реакцию, вызываемую низкими концентрациями ауксина. Несмотря на приведенное прямое доказательство роли Сконцевого домена в развитии ауксининдуцированного ответа замыкающих клеток, следует отметить, что моноклональные антитела к Сконцу белка не распознают АСБ1 на клеточной поверхности. Повидимому, изучаемый Сконцевой домен не является поверхностным, что согласуется с предположением о том, что он взаимодействует с якорным белком, в результате чего меняется конформация АСБ1 и маркерная КЭЕ1последовательность маскируется.