Генетическая трансформация растений томата геном preS2-S, кодирующим основной антиген оболочки вируса гепатита B, с целью получения кандидатной съедобной вакцины

• Автор: Столбиков, Алексей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВАКЦИНЫ

1.1. Типы вакцин

1.2. Съедобные вакцины

1.2.1. Критерии мукозных вакцин на основе трансгенных растений

1.2.2. Съедобные вакцины на основе растительного материала

1.2.3. Вакцина против гепатита В

2. ОСНОВЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МУКОЗНОЙ ИММУНОЙ

СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА

3. ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ В.

3.1. Краткая характеристика вирусного гепатита В
3.2. Структура генома гепатита В
3.3. Строение и функции внешней оболочки вируса гепатита В
3.4. Репликация и размножение вируса гепатита В в гепатоцитах.
4. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ОРГАНИЗМОВ.
4.1. Генетическая трансформация растительных объектов.
4.2. Методы получения трансгенных растений
4.2.1. Агробактермальная трансформация
4.2.2.Трансформация методом микроииъекций.
4.2.3. Электропорация
4.2.4. Бнобаллистнческая трансформация
4.2.5. Трансформация с помощью липосом
4.3. Агробактериальная трансформация растений томата
4.4. Способы генетической модификации животных
4.5. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
5. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
5.1. Растительный материал
5.2. Приготовление сред для проращивания семян и пересадки трансформировать проростков.
5.3. Обработка и проращивание семян.
5.4. Бактериальный штамм i i используемый для трансформации растений томата.
5.5. Культивирование i i
5.6. ЦР анализ бактериальной ДНК колонии
5.7. Трансформация эксплантов и пересадка их на селективную среду
5.8. Селекция и адаптация эксплантов
5.8.1. Селективный отбор проростков на среде с канамипином и пересадка их в сосуды с влажной фильтровальной бумагой.
5.8.2. Адаптация проростков, прошедших селекцию на канамицинс, к условиям внешней среды
5.8.3. Пересадка проростков в почвенную среду.
5.9. Трансформация растений, выращенных в почве.
5. . Высадка растений в теплицу и уход за ними
5 Сбор и обработка плодов.
5 ПР анализ ДНК, выделенного из листьев и плодов растений, прошедших селекцию на канамицинс
5 ИФД экстрактов полученных из листьев и плодов трансформированных растений томата.
5 Использованные реактивы.
6. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
6.1. ПЦР анализ плазмидной ДИК, выделенной из бактериальных колоний.
6.2. Получение трансформированных растений и отбор трансформантов по активности селективного гена
6.2.1. Получение проростков растений томата.
6.2.2. Трансформация эксплантов.
6.2.3. Отбор трансформированных растений на селективной среде.
6.3. Адаптация растений, прошедших селекцию на канамнцине, к условиям внешней среды.
6.3.1. Адаптация к внешней атмосфере
6.3.2. Адаптация к почвенной среде
6.4. Высадка растений в грунт и уход за ними
6.5. Молекулярногенетические доказательства трансформации
6.5.1. ПЦРанализ плодов трансформированных растений томата поколения То
6.5.2. Иммуноферментный анализ
6.5.2.1. Иммуноферментный анализ листьев рас гений томата
поколения То
6.5.2.2. Иммуноферментный анализ плодов растении томата поколения
6.5.2.3. Иммуноферментный анализ листьев растений томата
поколения Т
6.5.2.4. Подтверждающий иммуноферментный анализ экстрактов плодов
растений томата поколения Т
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Инъекционные вакцины как правило индуцируют системный иммунитет, в то время как иммунизация слизистой часто приводит к стимуляции не только мукозного. Еще одним преимуществом оратьных вакцин на основе трансгенных растений является то, что они в отличие от вакцин полученных из клеток животных не несут случайных вирусных или бактериальных белков, которые способны вызывать нежелательные последствия i . Гепатит В очень распространенная и опасная вирусная инфекция. Каждый год в мире фиксируется млн. В. Из них до 0 тыс. Из числа последних около 0 тыс. Амосов, . Россия относится к рег ионам с высоким уровнем распространенности ВГВ, что представляет реальную угрозу для здоровья населения. Все эти факты наглядно показывают усиленную экспансию заболевания, которая вес более отчетливо начинает приобретать черты пандемии общечеловеческого масштаба. Эту ситуацию значительно усложняет рост числа лиц, употребляющих в виде инъекций сильнодействующие наркотические вещества. В последние годы существенно изменилась возрастная структура заболевших ВГВ, среди которых от до составляют лица в возрасте от до лет, что обусловлено парентеральным употреблен ием наркотических веществ Онищенко. Исходя из i этого, возникает необходимость в принятии глобальной программы по тотальной иммунизации населения от гепатита 3. Массовая вакцинация против гепатита В реально снижает заболеваемость хроническим гепатитом В и частоту бессимптомного носнтельства вируса гепатита В. Убедительные данные, подтверждающие это положение, получены на Тайване и в Гамбии, где массовая вакцинация новорожденных детей снизила среди них носительство вируса соответственно с ,5 и ,3 до 1,7 и 0,6. Чрезвычайно важно, что вакцинация против гепатита В привела к более чем двукратному снижению числа случаев первичного рака печени среди детей 6 лет. Кроме того, произошло реальное снижение числа случаев фульминантного гепатита В i, . Однако выполнение подобных мероприятий наталкивается на значительные трудности, связанные с дороговизной производства вакцин обычными способами и проблемой доставки препарата. Статистика показывает, что наибольшее распространение гепатит В получил в странах обладающих слабой экономикой, для которых провес. Но мнению многих специалистов съедобные вакцины способны эффективно разрешить трудности, связанные с массовой вакцинацией населения. Это вакцины обладают существенными преимуществами, это. Культивирование растений не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы производства обеспечивают доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для их широкого профилактического не пользован ия. Кроме того, съедобные вакцины против гепатита В могут быть получены путем ядерной трансформации, поэтому способность синтезировать вирусные антигены передастся следующим поколениям растений, а это в свою очередь снижает затраты на производство вакцин, таккак отпадает необходимость ежегодно проводить генегическую трансформацию растений. В настоящей работе представлены результаты трансформации растений томата целевым геном рге8 в варианте НОЕЬ и селективным геном пр1 II. В листьях и плодах полученных трансгенных растений с помощью ПЦР показано наличие в геноме растений целевого гена ргс8 и селективного гена пр1 II. Иммуноферментным анализом в листьях и плодах трансгенного томата выявлено значительное содержание основного поверхностного антигенного белка НВяЛ вируса гепатита В. Результаты исследования могут быть полезными для дальнейших работ по созданию съедобной кандидатной вакцины против гепатита В. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю члену корреспонденту РАН доктору биологических наук Рюрику Константиновичу Саляеву, а также доктору биологических наук Наталье Игоревне Рекославской та внимание, всестороннюю помощь в работе и ценные замечания при написании рукописи. Сердечная благодарность та обсуждение результатов, помощь в работе и доброжелательную атмосферу всем сотрудникам лаборатории Физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН.