Характеристика генов семейства SOD культурных (Zea mays) и дикорастущих (Larix sibirica, L. gmelinii) растений в связи с проблемой механизмов генетической регуляции

• Автор: Катышев, Александр Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 124 с. : ил.

1. Активные формы кислорода ЛФК

1.2. Химическая природа АФК

1.2. Цитотоксические эффекты АФК.

1.3. Биологические источники АФК.

1.4. Метаболизм АФК в клетках

2. Супероксиддисмутазы различные тины, эволюция структуры и функции ферментов

2.1. Железосодержащис СОД.

2.2. Марганецсодержащие СОД.

2.3. Камбиалистичсские СОД.

2.4. Медьщшксодержашис СОД.

2.5. Никсльсодсржащие СОД.

3. Исследования клеточных функций сунероксиддисмутаз.
3.1. Мутационный и комплементационный анализ.
3.2. Исследования биологической роли СОД с использованием трансгенных моделей и миметиков
. Характеристика генных семейств СОД растений
4.1. Структура генных семейств СОД растений
4.2. Регуляция экспрессии генов СОД растений.
4.3. Представления об эволюции структуры и функции генов СОД растений
5. Состояние исследований генов СОД у хвойных растений.
6. Итоги обзора литературы.
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1, Объект исследования.
2. Использованные методы.
2.1. Выделение ДНК.
2.2. Выделение РНК.
2.3. Подбор праймеров для ПЦР и ОТПЦР.
2.4. Условия ПЦР на геномной ДНК.
2.5. Синтез первой цени кДНК.
2.6. Условия ОТПЦР
2.7. Условия ЗИАСЕ
2.8. Условия 5ЛСЕ.
2.9. Электрофоретическое разделение продуктов синтеза первой цепи кДНК в денатурирующих условиях
2 Электрофоретическое разделение и очистка продуктов ПЦР, ОТПЦР, 3АСЕ и 5АСЕ
2 Клонирование фрагментов кДНК.
2 Выделение нлазмидной ДНК.
2 Условия секвестрования ДНК.
2 Саузсрнгибридизацня.
2 Нозернгнбридизация
2 Контекстный анализ нуклеотидных и аминокислотных послсдовательностей.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
I. Получение ОТПЦРнродуктов, соответствующих высококонсервативиым участкам генов СОД растений
1.1. Анализ последовательностей генов СОД растений и подбор праймеров
1.2. ОТПЦР на мРПК растении различных систематических групп.
2. Секвенирован не фрагмента кДНК гена РеСОД , доказательства широкого распространения генов РеСОД у растений и контекстный анализ аминокислотных последовательностей РеСОД.
2.1. Секвенирование и сравнение кДНК РеСОД кукурузы с высокогомологичнымн последовательностями других растений
2.2. Контекстный анализ аминокислотных последовательностей , Мп и камбиалистических СОД прокариот и эукариот
2.3. Стрсссоиндуцируемая экспрессия гена РеСОД
3. Исследование структуры гена хлоропластной Си1пСОД кукурузы.
3.1. Секвенирование и анализ кДНК гена хлоропластной СиХпСОД .
3.2. Сравнительный анализ структурных особеностей генов хлоропластных .
4. Исследование особенностей структуры генов СинСОД лиственницы.
4. 1. Секвенирование и анализ кДНК генов ix iii и . iii
4.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ Зконцевых последовательностей кДНК генов лиственницы.
4.3. Анализ 5концевых участков кДНК двух видов ix.
4.4. Определение количества копий генов ix iii и . iii с помощью методов Саузернгибридизацин и ПЦР
5. Исследование особенностей структуры генов МпСОД ix iii и . iii.7 5 I. Секвенирование и анализ кДНК гена МпСОД ix iii и . iii.
5.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ Зконцсвых последовательностей кДНК гена МпСОД ix iii и . iii
5.3. Определение коиийности генов МпСОД . iii и . iii с использованием методов ОТПЦР и ПЦР на геномной ДНК
5.4. Роль альтернативного полнаденилировання траискриптов генов МпСОД в регуляции экспрессии данных генов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АО антиоксидантная система АПО аскорбатпероксидаза АФК активные формы кислорода БАЛ 6бензоаминопурин БФС бромфеноловый синий ГПО глутатионпсроксидаза дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат кДГК Д К, комплементарная мРНК РМЭ рмеркаптоэтанол
НТП нетранслируемые последовательности мРНК НУК нафтилуксусная кислота
ОТПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транкрипцией
ПВП поливинилпирролидон
ПОЛ перскисное окисление липидов
ГСА персульфат аммония
ПЦР полимеразная цепная реакция
СОД супсроксиддисмутаза
ЭГ1Р эндоплазматический ретику лум
СТАВ цетилтриэтиламмонийбромид
дитиотрейтол
этилендиаминотетраацетат
концевые экспрессирующиеся последовательности
I изопропилРЭтиогалактопиранозид
2Ыморфолино этансульфонат калия
ЗрЧморфолино пропансульфоновая кислота
никотинадениндинуклеотид фосфат
полиэтиленгликоль
3 быстрая амплификация Зконцевых кДНК 5 быстрая амплификация 5концевых кДНК
трисборатный буфер
тетраэтилметилэтилендиамид
i 5бром3индолилР0галасгопиранозид
ВВЕДЕНИЕ


Аналогичные данные по генам СОД растений других таксономических групп, таких как однодольные и голосеменные растения, очевидно, являются недостаточными для формирования адекватных представлений о структуре генных семейств СОД у растений этих систематических групп. СОД растений в целом. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование структуры и экспрессии отдельных генов семейства СОД у таксономически удаленных видов растений для выяснения возможных механизмов регуляции их экспрессии. РНК генов СОД . СОД и Си2пСОД кукурузы . Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены молекулярнобиологические доказательства экспрессии гена Д кукурузы и определена частичная последовательность к ДНК данного гена. Эти данные наряду с обнаружением в электронных базах данных высокогомологичных последовательностей кДНК пшеницы ii iv и сорго i позволили опровергнуть существовавшую ранее гипотезу об эволюционном замещении функции генов РеСОД у растений генами, кодирующими . Впервые были определены последовательности кДНК и участков геномной ДНК генов, кодирующих хлоропластные у двух видов лиственницы. Впервые секвенированы последовательности кДНК и геномной ДНК генов МпСОД двух видов хвойных растений. Анализ ЗИТП мРНК данных генов показал наличие в их структуре альтернативных сигналов полиаденилирования, что повидимому, послужило причиной обнаруженного в данной работе полиморфизма длины транериптов гена МпСОД лиственницы сибирской и Гмелина. Обнаруженная эволюционная консервативность альтернативного полиаденилирования, выражающаяся в представленности потенциальных сигналов полиаденилирования в ЗНТП мРНК генов МпСОД растений разных систематических групп и животных, свидетельствует о вероятной высокой значимости альтернативного полиаденилирования как механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии данных генов. Апробация работы. Пенза, г, на всероссийской конференции Стрессовые белки растений Иркутск, , на международном симпозиуме Физиология трансгенного растения и биобезопасность Москва, , на международной конференции i i , Москва, . Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 8 печатных работах. Одна работа находится в печати Молекулярная биология. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 7 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 4 страницах, содержит рисунков и 4 таблицы. Автор выражает благодарность научному руководителю, доктору биологических наук . М. Константинову за хорошее идейное руководство, полезные советы и ценные критические замечания. Автор выражает благодарность коллективу лаборатории генетической инженерии растений СИФИБР СО РАН за моральную поддержку, методическую и экспериментальную помощь. Также автор выражает благодарность сотруднику ИЦиГ СО РАН Кобзеву Виктору Федоровичу за синтез олигонуклеотидов и сотруднику Межинститутского центра секвенирования Ренату Владимировичу Аделышшу, осуществлявшему автоматическое секвенирование. I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Основным источником энергии в аэробных биологических системах является восстановление молекулы кислорода до двух молекул воды, для осуществления которого необходимо четыре электрона. Поэтапное восстановление кислорода сопровождается образованием частично восстановленных продуктов, которые изза их высокой химической активности называют активными формами кислорода АФК. О2 с О2 . Н Н2. Н2 е I ОН Н. ОН е Н Н i, . Помимо указанных активных форм кислорода к АФК относят также и ряд других молекул и радикалов, образующихся в реакциях с участием супероксидного радикала, пероксида водорода и гидроксильного радикала синглетный кислород , пероксильные радикалы , алкоксильные радикалы , ряд окислителей, таких как гипохлорит НОС1, пероксинитрит , а также озон О3 i, i, . Озон образуется преимущественно в верхних слоях атмосферы из кислорода в результате возбуждения электронов атомов кислорода иод действием ионизирующего излучения, ультрафиолета.