Исследование свойств растительной ДНК-топоизомеразы I ядер и митохондрий в системах in vitro и in vivo

• Автор: Тарасенко, Владислав Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Топологические состоянии ДНК.

2. Механизм действия ДНКтопоизомераз.

2.1. Топоизомеразы типа IА

2.2. Топоизомеразы типа 1В

2.3. Топоизомеразы типа II

3. Ингибиторы топо 1

3.1. Камптотецин и его производные

3.2. Малобороздочные лиганды
4. Геном митохондрий и регуляция его активности.
5. Характеристика ДНКтопоизомераз из различных объектов
5.1. Ферменты ядерной локализации.
5.2. ДНКтопоизомеразы I хлоропластов.
5.3. ДНКтопоизомеразы I митохондрий
6. Биологическая роль ДНКтопоизомераз.
6.1. Роль топоизомераз в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК.
6.2. Роль ДНКтопоизомераз в процессах экспрессии генов.
6.3. Протеин киназная активность ДНКтопоизомеразы I
7. Регуляция активности ДНКтоноизомеразы 1.
7.1. Изменения уровня активности топо I в эукариотической клетке
7.2. Регуляция экспрессии гена топо 1.
7.3. Фосфорилированис и полиАДФрибозилирование молекул белка
7.4. Ассоциация топо I с другими белками
8. Итоги обзора литературы
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Объект исследования
2. Использованные методы
2.1. Выделение митохондрий
2.2. Лизис митохондрий Тритоном Х0 и фракционирование сульфатом аммония.
2.3. Выделение ядер.
2.4. Солевой лизис ядер и митохондрий.
2.5. Хроматографическая очистка митохондриальной топо I.
2.6. Хроматографическая очистка ядерной ДНКтопоизомеразы 1.
2.7. Определение активности ДНКтопоизомеразы 1.
2.8. Электрофоретический анализ ДНК.
2.9. Детекция одноцепочечных разрывов в плазмидной ДНК
2 Определение содержания белка
2 Электрофоретический анализ белков.
2 Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.
2 Выделение плазмидной ДНК
2 Приготовление растворов ингибиторов и редоксагснтов
2 Повторность и статистическая обработка результатов
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение и очистка ДНКтопоизомеразы I ядерной и митохондриальной локализации
2. Сравнительная характеристика биохимических свойств митохондриальной и ядерной ДНКтопоизомеразы 1
2.1. Зависимость активности ферментов от ионов 2.
2.2. Влияние ионной силы раствора.
2.3. рПзависимость изучаемых ферментов.
2.4. Воздействие на топоизомеразную активность температуры
2.5. Эффект спермидииа
2.6. Способность фермента релаксировать положительные супервитки
2.7. Стабильность изолированных ферментов.
3. Эффект ингибиторов топо I i viv и i vi.
3.1. Действие камптотецина на активность топо I из ядер и митохондрий
3.2. Эффекты камптотецина на культуру растительных клеток.
3.3. Действие малобороздочных лигандов на активность топо I.
3.4. Эффекты малобороздочных лигандов на культуру
растительных клеток
4. Связь активности топо I с пролиферацией
растительных клеток.
5. Редоксзависимость митохондриальной и ядерной ДНКтопоизомеразы 1
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Одна работа находится в печати. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 0 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 2 страницах, содержит рисунков и 8 таблиц. Автор выражает благодарность научному руководителю, доктору биологических наук Ю. М. Константинову за хорошее идейное руководство, полезные советы и ценные критические замечания. В живых организмах молекулы ДНК, являющиеся носителями наследственной информации, представляют собой либо очень длинные, либо замкнутые в кольцо двухспиральные молекулы. Поэтому любой процесс, связанный с передачей наследственной информации, должен наталкиваться па серьезные топологические проблемы возникновение положительной или отрицательной супсрспирализации ДНК, образование катенанов или узлов 1,2. К числу таких процессов прежде всего следует отнести репликацию ДНК 3,4. Длина расходящихся синтезированных цепей ДНК слишком велика для того, чтобы позволить репликативной вилке вращаться вдоль главной оси ДНК, в результате происходит нагнетание положительной супсрспирализации в родительской ДНК. Соответственно обе вновь образованные копии оказываются отрицательно суперспирализованными. При окончании репликации возможно также образование узлов или в случае кольцевых молекул катенанов. Нагнетание суперспирализации происходит сходным образом и в процессе транскрипции 5,6. Перепутывание сверхдлинных нитей ДНК происходит также в процессе конденсации и сегрегации хромосом, организации хроматина и некоторых других процессах 7. Проблема раскручивания молекулы ДНК может быть решена введением временного одноцепочечного разрыва. Наличие внутреннего свободного конца позволяет разрезанной цепи вращаться вокруг интактной цепи, после чего разрез должен быть ликвидирован. Реакция разрезания и сшивки может повторяться по мере продвижения репликационного или транскрипционного комплекса. Такие реакции осуществляются i viv ДНКтопоизомеразами. Для описания топологии дуплексной ДНК в настоящее время введено несколько специальных понятий 8. ДНК вокруг своей оси в дополнение к собственному закручиванию двойной спирали. Двух цепочечная ДНК может делать оборот либо в том же направлении, в котором закручена сама двойная спираль положительная суперспирализация, либо в противоположном направлении отрицательная суперспирализация. Положительная суперспирализация перекручивает двойную спираль, отрицательная суперспирализация недокручивает ее. Отрицательное скручивание может приводить к локальному разделению цепей, что имеет важное значение для функционирования ДНК. Введение отрицательных сверхвитков требует затрат энергии. Соответственно суперспирализованная молекула обладает большей свободной энергией, вследствие чего сверхвитки можно рассматривать как своеобразную форму запасания энергии в клетке. Все исследованные геномы проявляют некоторую отрицательную суперспирализацию. Введение положительных сверхвитков усиливает напряженность структуры ДНК. Такого состояния молекулы можно добиться различными воздействиями i vi, но оно не встречается в естественных условиях 9. Для описания суперспирализации введено понятие о числе зацеплений, которое определяет, сколько раз цепи замкнутой молекулы пересекают друг друга в пространстве. Для правозакрученной спирали эта величина всегда положительна и выражается целым числом. Число зацеплений включает два компонента, Т i и i, определяемых уравнением Т. Т число оборотов характеризует степень закрученности одной цепи ДНК вокруг другой. В релаксированной кольцевой молекуле ДНК Т соответствует отношению общего числа пар оснований к числу пар оснований в витке. характеризует число оборотов оси спирали в пространстве. Для релаксированной молекулы 0. В этом случае число зацеплений соответствует числу оборотов одной цепи вокруг другой Т.