Экспрессия рекомбинантных антител к ферритину человека в растительных системах

• Автор: Семенюк, Екатерина Геннадиевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 148 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение молекул антител. Структура генов иммуноглобулинов

1.2 Проблемы экспрессии моноклональных антител в гетерологичных системах. Инженерия антител

1.3 Трансгенные растения как продуценты рекомбинантных белков

1.4 Внутриклеточная сортировка белков. Роль эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи в посттрансляционной модификации белков. Механизмы секреции белков

1.5 Получение антител в трансгенных растениях

1.5.1 Стратегии обеспечения экспрессии и сборки молекул полноразмерных антител в клетках растений
1.5.2 Экспрессия бсРу фрагментов антител в различных компартментах растительной клетки
1.5.3 Биотехнологические аспекты производства антител в растительных системах
1.6 Использование бактериальных белков барназы и барстара в молекулярной биологии и физиологии растений
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.1 Условия культивирования бактерий
2.2 Растения
2. Условия культивирования растений
2.3Растворы, использованные в работе
2.4 Ферменты, использованные в работе
2.5 Другие растворы и буферы
2.6 Другие реактивы и материалы
2.7 Основное обрудование
2.8 Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК
2.9 Конструирование плазмид для трансформации растений
2. Введение метки в ДНК
2. Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах
2. Перенос ДНК на фильтры по Саузерну
2. Гибридизация на фильтрах по Саузерну
2. Трансформация листовых дисков табака
2. Выделение суммарной растительной ДНК
2. ПЦРанализ трансгенных растений
2. Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола
2. РНКДНК гибридизация
2. Получение и анализ белковых экстрактов трансгенных растений и клеточных культур
2. Аффинная очистка зсРуРПЬааг
2. Определение функциональной активности рекомбинантных антител
2. Иммунофлуоресцентная микроскопия
2. Получение суспензионной клеточной культуры
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Создание трансгенных растений соНапа аЬасит, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена
8сРТЬагз1аг
3.1.1 Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена бсРуБ 1Ьагзаг под контролем двойного промотора БСаМУ
3.1.2 Агробактериальная трансформация растений сойапа аЬасшп конструкциями на основе гена бсРуБ 1Ьагз1аг
3.2 Молекулярногенетический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена эсТМИ Пэааг
3.3 Иммунохимический анализ растений табака, содержащих генетические конструкции на основе гена зсРуР1 Пэааг
3.4 Иммуновизуализация зсРуР1 Нэааг в тканях листа
3.5 Анализ поколения Р1 растений, содержащих различные варианты генетических конструкций на основе гена бсРуР1 1Ьаг1аг
3.6 Аффинная очистка БсРуРПЬааг из трансгенных растений и определение функциональной активности очищеных антител
3.7 Характеристика суспензионной клеточной культуры соНапа аЬассопродуцента миниантител
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Эти белки синтезируются в организме позвоночных только Вклетками лимфоидного ряда и отличаются способностью распознавать и специфически связывать чужеродные молекулы антигены, а также включать механизм их элиминирования, выполняя тем самым защитную функцию антител. У каждого индивидуального организма существует огромное разнообразие иммуноглобулиновых молекул, различающихся по структуре полипептидных цепей и, как следствие, по специфичности. Е. Различные классы имеют свои структурные и функциональные особенности, но общая организация молекул сохраняется у всех представителей этого многочисленного семейства. Мономерная молекула антитела построена из четырех полипептидных цепей двух идентичных тяжелых Н и двух одинаковых легких Ь. В пространственной структуре и легкой и тяжелой цепей четко прослеживаются домены, отвечающие отрезкам последовательности, которые содержат примерно 0 аминокислотных остатков. Домены сходны по способу укладки полипептидной цепи и могут быть отнесены к рструктурным белкам. Все четыре цепи ковалентно соединены дисульфидными связями, кроме того, имеются дисульфидные связи внутри доменов, стабилизирующие структуру отдельных глобулярных областей. Рис. V, остальная часть полипептида в пределах каждого класса антител изменяется мало и называется константной С областью. Последняя включает один домен у легких цепей и три или четыре домена в зависимости от класса у тяжелых цепей. В соответствии с классом антител различают пять основных типов тяжелых цепей иммуноглобулинов ц, 6, у, а и е. Легкие цепи представлены двумя типами, к и А. Как к , так и X цепи могут быть соединены в молекуле антитела с любым типом тяжелых цепей иммуноглобулина. К мономерам относятся иммуноглобулины классов и Е. I являются пентамерными молекулами, I могут быть представлены как мономерами, так и димерами и тетрамерами. Мономеры в структуре этих молекул связаны между собой соединительной цепью . V и V вариабельные домены тяжелой и легкой цепи формируют антигенсвязывающий центр, и, следовательно, на каждую мономерную молекулу иммуноглобулина приходится по два таких идентичных участка. Вместе с С 1 и константными доменами вариабельные домены образуют антигенсвязывающие фрагменты или отличаются и тем, что первый имеет лишь один активный центр и не способен к пространственному связыванию антигенных детерминант, в то время как второй является двухвалентным и способен к такому взаимодействию с антигенами. Эти фрагменты могут быть получены расщеплением молекулы I, соответственно папаином и пепсином , I . Существует один консервативный сайт для гликозилирования в молекулах антител класса I в составе Сн2 домена региона тяжелой цепи. Гликозилирование региона в молекулах сывороточных иммуноглобулинов обнаруживается только в случаев. Негликозилированные белки оказываются менее стабильными к протеолитической деградации и хуже взаимодействуют с рецепторами моноцитов . В геномах человека и мыши семейства иммуноглобулиновых генов сгруппированы в три независимых локуса два для генов легких и один для генов тяжелых цепей. Каждое из семейств включает множество генов, кодирующих вариабельные домены и Н цепей, и единичные гены константных областей, причем такие группы генов находятся на значительном расстоянии друг от друга. Образование легкой и тяжелой цепей происходит в результате рекомбинации одного из генов вариабельных доменов V с геном, кодирующим константный участок С. Между V и С генами находятся последовательности и , кодирующие небольшие фрагменты полипептидной цепи, входящие в вариабельные области. В таком строении генов заложено огромное разнообразие антител. При созревании Влимфоцитов происходит перегруппировка ДНК и транслокация одного из Vгенов к одному из сегментов в случае генов тяжелых цепей предварительно протекает рекомбинация между и участками. В результате такой V рекомбинации происходит сближение вариабельных и константных участков, а также промоторов, лежащих перед каждым Vгеном, и энхансеров, находящихся в интроне между и С сегментами и в дистальной 3области.