Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы

• Автор: Кузнецова, Марина Валентиновна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Бактериипродуценты нитрилгидратазы

1.1. Пути метаболизма нитрилов карбоновых кислот у бактерий

1.2. Бактерии, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот

1.3. Классификация и характеристика нитрилгидратаз

1.4. Механизм нитрилгидратазной реакции

1.5. Биохимическая регуляция активности нитрилгидратаз

1.6. Механизмы генетической организации и регуляции синтеза нитрилгидратаз

1.7. Перспективы использования штаммовпродуцентов нитрилгидратазы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. Объекты н методы исследования
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Среды и субстраты
2.3. Селекция штаммовпродуцентов нитрилгидратазы
2.4. Методы таксономического анализа
2.5. Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик
2.6. Определение активности ферментов метаболизма нитрилов карбоновых кислот, субстратов и продуктов биотрансформации
2.7. Методы энзиматического анализа
2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция
2.9. Статистическая обработка
Глава 3. Выделение и характеристика, штаммов продуцентов
нитрнлгидратазы
3.1. Выделение культур, утилизирующих нитрилы карбоновых кислот
3.2. Идентификация штаммовпроду центов нитрилгидратазы
3.3 Выделение ДНК и ПЦРамплификация генов нитрилгидратаз
Глава 4. Исследование влияния факторов среды на рост и нитрилгидратазную активность штаммов . i и .
4.1. Зависимость нитрилгидратазной активности клеток от фазы роста культуры
4.2. Нитрилы и амиды как ростовые субстраты
4.3. Оценка токсичности нитрилов и амидов
4.4. Утилизация ацетонитрила
4.5. Зависимость роста клеток и нитрилгидратазной активности от концентрации ацетонитрила
4.6. Индукция ферментов нитрилами и амидами
4.7. Влияние источника углерода на рост и нитрилгидратазную активность бактерий
4.8. Влияние источника азота на рост и нитрилгидратазную активность бактерий
4.9. Влияние ионов металлов на рост и нитрилгидратазную активность бактерий
Глава 5. Характеристика нитрил гидратаз штаммов . i
и .
5.1. Субстратная специфичность нитрилгидратаз
5.2. Влияние температуры на активность нитрилгидратаз
5.3. Влияние среды на активность нитрилгидратаз
5.4. Действие ряда ингибиторов на активность нитрилгидратаз
5.5. Конверсия акрилонитрила биомассой .
Заключение
Список литературы


Это редкий пример специфической регуляции внутриклеточных ферментов на уровне транскрипции ионами металла, которые являются простетическими группами энзима. Ионы кобальта индуцируют нитрилгидратазу . 1, а также необходимы для формирования активного центра белка, его вторичной структуры, стабилизации, и соответственно, уровня активности фермента ,8. В литературе представлена информация по генетическому контролю конверсии нитрилов карбоновых кислот у некоторых штаммов бактерий. В штаммах почвенных бактерий обнаружены хромосомные гены нитрилгидратазы и амидазы, контролирующие гидролиз нитрилов до соответствующей кислоты и аммония . Клонированы и секвенированы гены высоко и низкомолекулярной нитрилгидратазы . 1 , гены нитрилгидратазы i 1 , . 4 и 8 8. Структурные гены а и Рсубъединиц нитрилгидратаз находятся в одном локусе ДНК, но порядок расположения их кодирующих последовательностей у разных штаммов различен , . Гены, ответственные за метаболизм нитрилов у кобальтсодержащего штамма . М8, имеют другую организацию и составляют регулон 4. Таким образом, нитрилгидратазный путь метаболизма нитрилов широко распространен у бактерий. Биохимическая регуляция активности, генетическая организация и энзиматические свойства нитрилгидратаз разных штаммов различаются в значительной степени. Опубликованные данные исследований не дают полного представления о разнообразии и механизмах регуляции метаболизма нитрилов у бактерий. Цель настоящего исследования Изучение физиологобиохимических свойств новых селектированных штаммов бактерийпродуцентов нитрилгидратазы. Выделить микроорганизмы, способные утилизировать нитрилы карбоновых кислот путем двустадийного гидролиза. Отобрать и идентифицировать штаммы с высокой нитрилгидратазной активностью. Определить локализацию генов нитрилгидратаз селектированных штаммов. Исследовать влияние различных факторов среды на рост и нитрилгидратазную активность штаммовпродуцентов. Охарактеризовать нитрилгидратазы определить субстратную специфичность ферментов, и температурную зависимость, действие ингибиторов на ферментативную активность. Дать сравнительный анализ выделенных культур по каталитическим свойствам и оценить возможность их применения в технологии синтеза акриламида. Научная новизна. i и . Показана хромосомная локализация генов нитрилгидратаз данных штаммов. Установлено, что нитрилгидратазная активность изученных штаммов снижается при повышении концентрации глюкозы в среде, а биосинтез железозависимой нитрилгидратазы . Установлено, что присутствие индуктора, нитрила или амида, не является обязательным для проявления нитрилгидратазной активности у обоих штаммов. Выявлены существенные различия влияния факторов среды на нитрилгидратазную активность . . и ранее известных штаммов продуцентов нитрилгидратазы. Показано, что нитрилгидратазы выделенных штаммов обладают широкой субстратной специфичностью и гидратируют бензонитрил и 3цианопиридин с более высокой скоростью, чем известные промышленные штаммы. Обнаружено, что нитрилгидратаза . устойчивости, чем фермент . Теоретическое и практическое значение работы. Создана лабораторная коллекция бактерий, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот. Выполненные исследования расширяют представления о разнообразии бактерий, экспрессирующих нитрилгидратазы, регуляции метаболизма нитрилов, возможности использования новых штаммов для синтеза амидов. Выделенные штаммы и полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования технологии синтеза акриламида, для получения других химических соединений, а также для разработки биотехнологических методов очистки окружающей среды. Селектированные штаммы . . метаболизируют алифатические и ароматические нитрилы, динитрилы и амиды нитрилгидратазно амидазным путем. Гены аи рсубъединиц нитрилгидратаз имеют хромосомную локализацию. Нитрилгидратаза . . кобалызависимым ферментом.