Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis

• Автор: Кириллова, Юлия Марсельевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 143 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Протеи пазы и их роль в метаболизме клетки.

ф 1. Основы классификации протеиназ.

2. Основные свойства и характнристика ссрииовых протеиназ.

2.1. Классификация субтилизиноподобных ферментов

2.2. Структура, свойства и характеристика субтилаз

3. Субтилизинонодобная сериновая иротеиназа В.ii.

II. Механизмы регуляции биосинтеза протеиназ

1. Регуляция экспрессии генов .ii на уровне транскрипции.

2. Механизмы регуляции синтеза внеклеточных протеиназ.

2.1. Механизм сигнальной трансдукции
2.2. Система фосфопередачи.
2.3. Системная регуляция сигмафакторами
2.4. Катаболитная репрессия.
Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
I. Закономерности синтеза субтилизиноподобной протеиназы
В.ii рекомбинантным штаммом .ii.
1.1. Динамика роста, биосинтеза субтилизиноподобной
протеиназы .ii и спорообразования рекомбинантного штамма .ii.
1.2. Влияние факторов среды на экспрессию гена
субтилизиноподобной протеиназы .ii рекомбинантным штаммом .ii.
1.2.1. Влияние пептона и неорганического фосфата на экспрессию
гена протеиназы.
4 1.2.2. Влияние белковых субстратов на экспрессию гена
протеиназы.
1.2.3. Влияние дрожжевого экстракта на экспрессию гена
протеиназы.
1.2.4. Влияние ионов аммония на экспрессию гена протеиназы
1.2.5. Влияние сахаров на экспрессию гена протеиназы.
1.2.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на экспрессию гена протеиназы
1.2.7. Влияние аминокислот на экспрессию гена протеиназы
1.2.8. Влияние казаминовых кислот в качестве единственного источника углерода на экспрессию гена протеиназы
II. Взаимосвязь синтеза внеклеточной субтилизнноподобной
сериновой протеиназы со спорообразованием.
2.1. Роль катаболитной репрессии в регуляции синтеза
протеиназы на разных фазах роста рекомбинантного
штамма В.бчЫШз
2.2. Влияние БроОЛ мутаций на экспрессию гена субтилизнноподобной сериновой протеиназы ВАМегтеШив.
2.3. Влияние супрессорной вроОАаЬгВ мутации на экспрессию гена субтилизнноподобной сериновой протеиназы ВлШегтейшъ
2.4. Влияние эроОГ и БроОВ мутаций па экспрессию гена субтилизнноподобной сериновой протеиназы ВАМеппесИю.
2.5. Влияние ктА мутаций на экспрессию гена
субтилизнноподобной сериновой протеиназы ВАМегтесНиэ
2.6. Влияние зроОЕ и БроОК мутаций на экспрессию гена субтилизнноподобной сериновой протеиназы ВАписгтеАшз.
2.7. Влияние БроОН мутаций на экспрессию гена субтилизнноподобной сериновой протеиназы ВАМеппесИиБ.
2.8. Влияние офактора транскрипции на экспрессию гена субтилизнноподобной сериновой протеиназы ВАМегтеАшБ
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
1. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы
ВАМегтесИиБ рекомбинантным штаммом ВлиЫШ.
, 2. Взаимосвязь синтеза внеклеточной субтилизиноподобной
ссриновой протеиназы со спорообразованием. .
4 ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Определение молекулярных механизмов регуляции синтеза гидролитических ферментов позволит направленно влиять на уровень продукции тех из них, которые интересны в практическом отношении. Грамположительные спорообразующие бактерии . Балабан с соавт. Фермент был выделен из культуральной жидкости, очищен до гомогенного состояния, изучены его физикохимические свойства. Клонирование гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы . Целью работы явилось выяснение механизмов контроля экспрессии гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы . Изучение регуляции биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы . Определение значимости катаболитной репрессии в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы . Выяснение роли регуляторных белков компонентов сигнальносенсорной системы i в регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы . Определение вклада , белков, участвующих в инициации спорогенеза, в регуляцию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы . Исследование влияния спороспецифичных ан и аЕфакторов транскрипции на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы . Исследования поддержаны грантами РФФИ 7, 2, Академии Наук Республики Татарстан 3. Научная новизна. Новизна работы заключается в использовании качественно нового подхода к изучению механизмов регуляции биосинтеза протеиназы, основанного на методах генной инженерии. Впервые установлено, что субтилизиноподобная сериновая протеиназа активно синтезируется и секретируется на стадии стационарного роста. Выявлено две пиковые фракции, из которых вторая превышает первый в 3 раза. Разработаны условия для активной экспрессии каждого из пиков, соответствующих фазе вегетативного роста и формированию эндоспоры. Использование рекомбинантного штамма дало возможность показать, что ферменты обеих фракций являются результатом экспрессии одного гена. Впервые проведено изучение механизмов контроля экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы . Получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы В. Е факторов транскрипции. Практическая ценность работы. Полученные нами сведения о механизмах контроля экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы на разных стадиях роста, включая переход к клеточной дифференцировке, могут быть полезны при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бацилл. Апробация работы. Татарстан Казань, , в республиканском конкурсе научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии им. Н.И. Лобачевского Казань, , . Публикации. По материалам диссертации опубликовано работ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Согласно современной классификации протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз и образуют особый подкласс пептидгидролаз КФ 3. Классификация протеиназ основана на их каталитических свойствах, а именно на структуре активного центра. В соответствии с ней протеиназы делят на четыре большие группы сериновые, цистеиновые, аспарагиновые и металлопротеиназы , . Эти группы протеиназ различаются по чувствительности к различным ингибиторам. Так, сериновые протеиназы ингибируются фенилметилсульфонилфторидом и диизопропилфторфосфатом . Металлопротеиназы хелатирующими агентами ЭДТА и офенантролин цистеиновые протеиназы тяжелыми металлами и иодацетамидом аспарагиновые протеиназы пепстатином. Классификация протеиназ хорошо коррелирует с их оптимумом действия. Сериновые протеиназы имеют оптимум в щелочной зоне, цистеиновые и аспарагиновые протеиназы в кислой области , а металлопротеиназы в нейтральной области. Металлопротеиназы продуцируют бактерии, актиномицеты и микроскопические грибы. Ферменты имеют молекулярную массу кДа, в состав их молекул входит двухвалентный металл, чаще всего цинк. Для стабильности белков необходимо присутствие ионов Са2. Металлопротеиназы в пептидах предпочтительно гидролизуют связи между аминогруппой лейцина и фенилаланина. Ингибиторами нейтральных протеиназ являются хелатирующие агенты ЭДТА и офенантролин, которые блокируют ионы металлов, что приводит к нарушению каталитической активности фермента, которая максимальна при 7,0. Цистеиновые тиоловые протеиназы в мире микроорганизмов встречаются относительно редко.