Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ

• Автор: Горяев, Артем Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПРОФАГ ВИРУЛЕНТНОСТИ СТХср СТРУКТУРА ГЕНОМА И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

1.1. Профаг вирулентности СТХр

1.1.1. Коровая область.

1.1.2. .

1.2. Жизненный цикл профага СТХр

2.1. Вариабельность генома ирофага СТХр.

2.2. Гибридные штаммы V биовара эльтор, несущие профаг СТХф

классического биовара
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Питательные среды и культивирование штаммов.
2.3. Методы
2.3.1. Определение продукции растворимой гемагглюгининиротеазы, подвижности и способности формировать биопленку.
2.3.2. Оценка продукции холерного токсина с помощью реакции пассивного иммунного гемолиза и иммуноферменого
2.3.3. Определение биологической активности холерного токсина по
Стр.
методу Сгс.
2.3.4. Конъюгационные скрещивания донорных и реципиентных штаммов
2.3.5. Внедрение транспозона Тп5МоЬ в хромосому штаммов У.сИоегаеАЗ
2.3.6. Выделение хромосомной и плазмидной ДНК
2.3.7. Рестрикционный анализ плазмидной и хромосомной ДНК
2.3.8. ПЦРанализ бактериального генома исследуемых штаммов с использованием различных специфичных олигонуклеотидных праймеров
2.3.9. Определение копийности генов схЛВ, кодирующих биосинтез холерного токсина, с помощью ДНКДНК гибридизации
2.3 Секвенирование генов холерного оперона.
2.3 Протеомный анализ
2.3 Определение продукции белков внешней мембраны с помощью электрофореза в полиакриламидном геле
2.3 Получение очищенного холерного токсина и специфических поликлональных антител к нему
2.3 Внутрикишечное заражение крольчатсосунков клетками изогенных штаммов с разным уровнем продукции холерного токсина
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСПОЗОННЫХ МУТАНТОВ V.СНОЬЕКАЕ БИОВАРА ЭЛЬТОР С ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА.
3.1. Введение в клетки модельного штамма УсИо1егае биовара эльтор
рекомбинантной плазмиды р8ЦР Арк СтяКтк, содержащей транспозон Гп5МоЬ.
3.2. Получение транспозонных мутантов Кш , Ар, Ст с измененной
продукцией холерного токсина.
3.3. Фенотипический анализ инсерциоиных мутантов с измененной продукцией холерного токсина.
3.4. Сравнительный анализ вирулентных свойств различных мутантов с
измененным уровнем биосинтеза холерного токсина
ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАНСПОЗОННЫХ МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА
4.1. Изучение активности регуляторных генов охЛ и 1охТ, контролирующих экспрессию генов ахАВ
4.2. Сравнительный анализ структуры генома нрофага СТХф у исходного
штамма и его транспозонных мутантов
4.3. Определение количества копий профага СТХф в хромосоме полученных транспозонных мутантов.
4.4. Секвенирование оперопа МхАВ штаммов МАК7 и его транспозонных
мутантов.
4.5. Анализ плазмидного профиля штамма Кш Тох.
ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТЕОМОВ УСНОЬЕВАЕ МАК
И ЕГО ТРАНСПОЗОННОГО МУТАНТА С ГИПЕРПРОДУКЦИЕЙ ХОЛЕРНОГО
5.1. Получение и сравнительный анализ протеомных карт изучаемых
штаммов.
5.2. Выявление белков, изменивших экспрессию в результате влияния на них
транспозонной мутации в геноме профага СТХф.
ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА 2 ТИПА И ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ АНТИСЫВОРОТКИ К НЕМУ.
6.1. Определение оптимальных условий культивирования сконструированного штамма гипер роду цента холерного токсина
6.2. Выделение и очистка холерного токсина 2ого типа
6.3. Получение специфической поликлональной антисыворотки к холерному токсину 2ого типа
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
X холерный токсин
ТКПА токсинкорегулируемые пили адгезии
РГАП растворимая гемагглютининпротеаза
МЧПА маннозочувствительные гемагглютинирующие пили адгезии
белки внешней мембраны V.
цАМФ циклический аденозинмонофосфат
I3 1,4,5трифосфат инозитол
диацилглицерол
РКСа протеинкиназа Са
МГЭ мобильные генетические элементы
1 остров патогенности
СТХф умеренный нитевидный бактериофаг, несущий СТХэлемент
1 умеренный нитевидный бакгериофаг, фланкирующий профаг СТХф
VI МГЭ, остров патогенности от Vii ii I
V МГЭ, остров папдемичности от Vii v i I
X конъюгативный транспозон, отвествснный за
антибиотикорезистентность от x, ii кДа килодальтон
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
I матричноактивированная лазерная десорбцияионизация от ix
i iIii
РПИГ реакция пассивного иммуннного гемолиза ЛТС антитоксическая сыворотка
ПААГ полиакриламидный гель
АВТЭ 2,2 аппосНШуШеЫагоНпе зи1рЬопа1е
ЕР5 экзополисахарид
ВВЕДЕНИЕ
АКТУАЛЬНОСТЬ


Фенотипический анализ инсерциоиных мутантов с измененной продукцией холерного токсина. ГЛАВА 4. Определение количества копий профага СТХф в хромосоме полученных транспозонных мутантов. Анализ плазмидного профиля штамма Кш Тох. ГЛАВА 5. Получение и сравнительный анализ протеомных карт изучаемых
штаммов. СТХф. ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА 2 ТИПА И ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ АНТИСЫВОРОТКИ К НЕМУ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ. МЧПА маннозочувствительные гемагглютинирующие пили адгезии
белки внешней мембраны V. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Напряженная эпидемическая ситуация в мире, обусловленная продолжающимися вспышками и эпидемиями холеры в странах ЮгоВосточной Азии и Африки, создают реальную возможность завоза этой инфекции на территорию России Андрусенко и др. Ломов, Марамович и др. К настоящему времени известно, что в результате эволюции в пределах вида образовалось три эпидемически опасных штамма, отличающихся друг от друга по структуре и функциям генома V серогруппы классического биовара, V. V. серогруппы. V. классического биовара был, видимо, возбудителем первых шести пандемии гг. Однако к началу прошлого столетия эти вибрионы были вытеснены на эндемичной для них территории холерными вибрионами биовара эльтор, которые вызвали текущую, 7ю, пандемию холеры, начавшуюся в г. Барояи, Смирнова, Кутырсв, . Что касается внезапно появившегося в г. Индии и Бангладеш эпидемически опасного штамма V. Смирнова, . Секвенирование генома V. МГЭ умеренных профагах СТХср и 1, островах патогенности VI1, VI2 и пандемичности V1, V2. X, биосинтез которого определяется генами x. СТХср. При этом холерные вибрионы классического биовара продуцируют X 1ого типа, V биовара эльтор X 2ого типа. Наличие большого числа МГЭ определяет высокую вариабельность генома возбудителя холеры, которая выражается в изменении его размеров и функции за счет потери или приобретения мобильных элементов. Такие изменения генома могут обусловить появление новых клонов с разным набором генов патогенности. Так, в последнее время происходит формирование патогенных клонов V. МГЭ, либо их отдельных генов, характерных только для классических вибрионов. Наибольший интерес представляют штаммы V. СТХф и продуцирующие X 1ого типа. Такие штаммы, как правило, более вирулентные, вызвали эпидемические вспышки холеры в Бангладеш, Мозамбике, Индии и Вьетнаме . Наряду с появлением атипичных штаммов с повышенной вирулентностью, значительную проблему представляют и нетоксигенные клоны, сохранившие весь набор других известных генов патогенности. Эти штаммы являются потенциально эпидемически опасными и способны вызывать диарейные заболевания за счет, видимо, дополнительных факторов патогенности Онищенко и др. Монахова и др. Одним из возможных механизмов образования таких атоксигенных клонов может быть спонтанная утрата генома профага СТХф Кульшань и др. Смирнова и др. Таким образом, очевидна актуальность исследований, направленных на дальнейшее изучение механизмов формирования атипичных штаммов с измененными вирулентными свойствами У. В первую очередь большой интерес представляют исследования механизмов образования высокотоксигенных штаммов УсЬоегае биовара эльтор. Эта проблема имеет не только существенное фундаментальное значение, но и представляет практическую ценность, поскольку штаммы с высоким уровнем продукции XI 2ого типа могли бы использоваться для получения этого белка, необходимого для создания более эффективных холерных диагностических и профилактических препаратов. Широкое распространение среди разных штаммов транспозонов, локализованных на плазмидах или входящих в состав интегронов, и их большой вклад в эволюцию патогенных бактерий позволяют рассмотреть возможность их участия в изменении продукции холерного токсина у возбудителя холеры эльтор. ЦЕЛЬ РАБОТЫ получение и сравнительный анализ фенотипических и молекулярногенетических свойств различных атипичных по продукции холерного токсина штаммов УсИо1егае биовара эльтор. С помощью транспозона Тп5МоЬ Ктк на модельном штамме УсИоегае МАК7 биовара эльтор получить мутанты с измененной продукцией ХТ.