Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius 3-19 : Биосинтез, выделение, характеристика, кристаллизация

• Автор: Шакиров, Евгений Витальевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протсолитических 9 ферментов

2. Сериновые нротеиназы

2.1 Субтилизины и субтилизиноподобные протсиназы

2.1.1 Классификация субтилизиноподобиых протеиназ

2.1.2. Общая характеристика субтилаз

2.1.3. Секретируемые субтилизины бацилл и их аналоги

2.2. Характеристика химотрипсиноподобных,протеиназ

V
2.3. Сериновые протеиназы стрсптомрдетой
2.4. Глутамнлэндонептидазы особое подсемейство химотрипсиновых протеиназ микроорганизмов. Физикохимические свойства и субстратная специфичность
2.5. Рентгеноструктурный анализ и функциональная организация глутамилэндопептидаз.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Отбор акгивных штаммов и исследование состава
питательной среды для обеспечения высокой продукции глутамилэндоиентидазы В.ШегтеМиь
1.1. Отбор продуцентов внеклеточной глутамилэндопептидазы по уровню максимальной продукции.
1.2. Изучение динамики роста культуры и биосинтеза фермента.
1.3. Влияние источников углерода на биосинтез глутамилэндопептидазы.
1.4. Влияние концентрации пептона и неорганического фосфата на
биосинтез глутамилэидопептидазы.
1.5. Влияние аминокислот, субстратов протеиназы и других факторов на биосинтез глутамилэидопептидазы
1.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на биосинтез протеиназы.
2. Выделение, очистка и характеристика глутамилэидопептидазы В.ii
2.1. Получение гомогенного препарата глутамилэидопептидазы из культуральной жидкости .ii
2.2. Физикохимическая характеристика глутамилэидопептидазы
Степень чистоты и молекулярная масса фермента
Кинетические параметры и изоэлектрическая точка фермента
3. Энзиматические свойства глутамилэидопептидазы
3.1. оптимум и рНстабилыюсть
3.2. Температурный оптимум и термостабильность фермента
3.3. Влияние ионов двухвалентных меташов на активность глутамилэндопептидаз
3.4. Влияние ингибиторов на активность глутамилэндопептидаз
3.5. Субстратная специфичность глутамилэидопептидазы
.ii
4. Аминокислотный состав и концевая последовательность
5. Выращивание и предварительный анализ кристаллов 0 гл утам и лэндопептидазы В. ii
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Согласно современной классификации ферменты, осуществляющие гидролиз субстратов на отдельные фрагменты, относятся к классу гидролаз класс 3. В составе этот класса ферменты, гидролизующие пептидные связи в белках и пептидах, образуют особый подкласс пептидгидролаз протеазы 3. Протеазы в свою очередь разделяются на пептидазы экзопептидазы 3. Принятая классификация пептидгидролаз основана на двух важных критериях специфичности и структуре активного центра. Пептидазы классифицируются по положению расщепляемой связи в пептидной цепи, а протеиназы по структуре активного центра , . Недостаток такой классификации состоит в том, что здесь используются два совершенно разных признака специфичность расщепляемой связи и структура активного центра фермента. Кроме того, существуют ферменты, обладающие как экзо, так и эндопеитидазной активностью. С другой стороны, очевидны преимущества такой единой классификации, которая создает основу для рассмотрения структуры и механизма действия ферментов с единых позиций. Группа экзопептидаз разделяется на несколько подгрупп ферментов. Аминопептидазы КФ 3. конца полипептидной цепи. Дипептидазы КФ 3. Дипептидилпситидазы КФ 3. КФ 3. и С конца белковой цепи соответственно. Следующие три группы экзопептидаз это карбоксипептидазы сериновыс карбоксипептидазы КФ 3. КФ 3. КФ 3. Особую группу составляют омегапептидазы КФ 3. конца, так и с Сконца полипептида. Протеиназы эндопептидазы на основе строения активного центра подразделяются на 4 основные класса сериновыс протеиназы КФ 3. КФ 3. КФ 3. КФ 3. Большинство цистеиновых протеиназ функционируют в слабокислой и нейтральной средах 5,07,0, однако встречаются ферменты этой группы, способные функционировать и при слабощелочных значениях . Эти протеиназы относительно редко встречаются в мире микроорганизмов. Известны стрептококковая протеиназа А и клостридиопептидаза В из ii iii. Аспартильные карбоксильные протеиназы в большинстве своем функционируют при кислых значениях изза участия в процессе катализа кислых групп двух аспарагиновых остатков. К ним относятся пепсин животных и человека, аспергиллопсптидаза А из i ii и протеиназа из iii i. Эти протеиназы устойчивы и активны в кислой среде и быстро инактивируются при нейтральных значениях . Исключение составляет фермент плазмы ренин, гидролизующий пептиды при 6,07,0. Активность аспартильных протеиназ подавляется диазокетонами, например, диазооксинорлейцином, а также микробным ингибитором пепстатииом. Однако, в этой группе ферментов встречаются ii к пепстатину ферменты, например, протеиназа из ii ii, в активном центре которой функционирует остаток не аспарагиновой, а глутаминовой кислоты. Одну из больших групп эндоиепгидаз составляют металлопротеиназы. Они содержат в своем составе ионы цинка, кобальта или марганца. Кроме того, некоторые из них например, термолизин содержат также ионы кальция, играющего важную роль в стабилизации пространственной структуры фермента. У некоторых ферментов этой 1руппы Сат и 2 являются важными для катализа. Металлопротеиназы обнаружены у растений, животных, человека, они продуцируются бактериями, актиномицетами и микроскопическими грибами родов i, , , i. Все металлопротеиназы инактивируются хелатирующими реагентами, такими, как этилендиаминтетрауксусная кислот ЭДТА и офенантролин, которые блокируют ионы металлов. Инактивация эта чаще всего обратима, то есть добавление иона металла восстанавливает активность. Сериновме протеиназы имеют в активном центре серии, гистидин и аспарагиновую кислоту, участвующие в процессе катализа. и другим фосфорорганическим соединениям, а также ко многим белковым ингибиторам. Другим общим признаком сериновых протеиназ является то, что они функционируют в щелочной среде. Как правило, они имеют рНоптимум 7,5 ,0. Многие сериновые протеиназы высоко активны в отношении различных белковых субстратов, гидролизуют казеин, гемоглобин, эластин, желатин.