Сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генетических свойств холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в период седьмой пандемии холеры

• Автор: Нефедов, Константин Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 141 с. : 12 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

СВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Мобильные генетические элементы Vii биопара

эльтор, связанные с вирулентностью

1.1.1 Бактериофаги.

1Л .2 Острова патогенности и пандемичиости.

1.1.3 Суперинтегроны и iiii V.

1.2. Изменения генома V. биовара эльтор в процессе эво

ЛЮЦИИ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1 Бактериальные штаммы.
2.2 Питательные среды и реактивы.
2.3. Методы.
2.3.1. Культивирование штаммов
2.3.2. Определение продукции растворимой гемагглютн
нинпротеазы
2.3.3 Определение подвижности
2.3.4. Определение продукции антигена
2.3.5 Определение чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам
2.3.6 Определение продукции маннозочувсгвительных гемагглютииирующих пилей адгезии
2.3.7 Определение способности формировать биопленку
2.3.8 Определение продукции холерного токсина
2.3.9 Определение конкурентных способностей
2.3. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.3. Выделение экзополисахарида и количественное определение его содержания
2.3. Полимеразная ценная реакция
2.3. Выделение хромосомной ДНК.
2.3. Секвеиировапие ДНК
2.3. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.3. Внутрикишечное заражение модельных животных.
2.3. Гибридизация хромосомной ДИК по Саузсрну и риботипи
рование штаммов V. биовара эльтор
ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ V. БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫДЕЛЕННЫХ ДО НАЧАЛА И В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ СЕДЬМОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ.
3.1. Изучение серологических свойств, чувствительности к диагностическим фагам и гемолитической активности.
3.2. Изучение основных биохимических свойств, связанных с вирулентностью
3.3. Сопоставление устойчивости к лекарственным препаратам
у предпандемнчсских и пандемических штаммов.
ГЛАВА 4. СТРУКТУРНЫЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА ПРЕДПАНДЕМИЧЕСКИХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬТОР
4.1. Распространение профагов и осгровов патогенности среди природных штаммов, выделенных до начала седьмой пандемии холеры
4.2. Выяснение присутствия в геноме нредпандемических штаммов регуляторных генов, контролирующих экспрессию основных генов вирулентности
4.3. Сравнение нуклеотидных последовательностей основных
структурных и регуляторных генов вирулентности предпандемических штаммов
4.4. Определение токсигенности и вирулентности прсдпандеми
чсских штаммов.
4.5. Определение присутствия острова персиситенции у пред
иандемичсских штаммов и изучение их способности к образованию биопленки
ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ШТАММОВ V. БИОВАРА ЭЛЬТОР, ВЫ
ЗВАВШИХ 7Ю ПАНДЕМИЮ ХОЛЕРЫ
5.1. Выявление в геноме пандемических штаммов новых мо
бильных элементов островов пандемичности V1 и V2
5.2. Сравнительный анализ жизнеспособности иредпандемиче
ских и пандемических штаммов V. биовара эльтор
5.3. Молекулярное тинирование штаммов холерных вибрионов
эльтор, выделенных до и во время седьмой пандемии
ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПРИРОДНЫХ
ШТАММОВ V. БИОВАРА ЭЛЬТОР ВЫДЕЛЕННЫХ ВО ВРЕМЯ 7ОЙ ПАНДЕМИИ ХОЛЕРЫ
6.1. Выявление природшлх штаммов с дефектными геномными островами, связанными с вирулентностью или паидсмично
стью.
6.2. Вариабельность геномов ирофагов СГХф и 1 р 1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСГЮЛЪЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
кДа килодалмон
МГЭ мобильные генетические элементы
ОП остров патогенности
ПЦР полимеразная ценная реакция
п. н. пар нуклеотидов
РГАП растворимая гемагглютининлротеаза
т.н.н. тысяча пар нуклеотидов
асе ген, кодирующий биосинтез дополнительного холерного токсина
участок хромосомы, в который внедряется фаг СТХр
x гены, кодирующие биосинтез холерного токсина
СТХф умеренный нитевидный бактериофаг, несущий гены x
СТ холерный токсин
экзополисахарид ог англ. xvi
ген, кодирующий синтез растворимой гемагтлютининпротсазы
x регуляторный белок системы i
хХ, x,
, регуляторные гены
маннозочувствительные гемагглютинирующие пили адгезии англ. iiv ii
белки порины внешней мембраны V.
кластер генов, ответственных за биосинтез рРНК
умеренный нитевидный бактериофаг
I

VI

ген, кодирующий синтез токсина X холерного вибриона
суперинтегрон от англ. i
токсин корегулирусмые пили адгезии от англ. xi i
ген, кодирующий биосинтез основной субъединицы токсинкорегулируемых пилей адгезии
глобатьный регуляторный ген
МГЭ, остров патогенности от англ. Vii ii i
МГЭ, остров нандемичности от англ. Vii v i i
ген, кодирующий синтез токсина зонального поглощения
ВВЕДЕНИЕ
АКТУАЛЬНОСТЬ


Изучить распространенность профагов и геномных островов, связанных с вирулентностью и персистентностью, среди предпандемических штаммов V. Ио1егае биовара эльтор. Исследовать экспрессию генов вирулентности и персистенции, локализованных в геноме предпандемических штаммов. Изучить распространенность островов пандемичности УЫМ и У5Р2 среди различных пандемических изолятов определить роль последних в жизнеспособности этих штаммов. Провести молекулярное типирование штаммов V. Изучить генетическое разнообразие природных штаммов V. Иокгае биовара эльтор, выделенных на разных территориях во время эпидосложнений по холере. Показано, что предпандемические штаммы V. Вместе с тем впервые выявлено, что предпандемические штаммы, в отличие от пандемических, не имели устойчивости к изученным антибиотикам. При сравнительном анализе геномов нредиандемических и пандемических штаммов обнаружено, что регуляторные гены охЯ, 1ихХ, им и рерА, входящие в состав различных систем регуляции, являются наиболее древними. Впервые определено присутствие в геноме всех изученных предпаидсмических штаммов острова персистенции в окружающей среде ЕР1, что указывает на его древнее происхождение. Установлено наличие в геноме вирулентных предпандемических штаммов двух копий профага СТХр и дефектного острова патогенности УР, лишенного одного гер3 или двух папН, гер3 тестируемых генов. Показано широкое распространение двух островов пандемичнооти У5Р1 и У5Р2 среди штаммов V. Новыми являются данные о генетическом разнообразии природных клинических штаммов, связанном с нестабильностью геномов VI2, а также V1 и V2. Впервые обнаружено, что риботиппрование и ПЦРтипирование позволяют дифференцировать предпандемические и пандемические штаммы V. Приоритетное значение имеют результаты, полученные при анализе функций геномов мобильных элементов. Выявлен высокий уровень экспрессии генов , локализованных в составе I, что свидетельствует об участии этого геномною острова в образовании биопленки предпандемнческими штаммами. Впервые экспериментально доказана более высокая жизнеспособность пандемических штаммов в водной среде по сравнению с иредпандемическими изолятами, что с высокой вероятностью связано с присутствием в геноме первых островов пандемичности V1 и V2. Создан комплекс мультиплексных ПЦР, предназначенных для выявления в геноме штаммов V. На основе разработанных тестсистем оформлены методические рекомендации Мультиплексный ПЦРанализ для изучения генетического разнообразия и выявления атипичных штаммов Vii биовара эльтор, которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ Микроб протокол от декабря г. Создана коллекция, состоящая из авторских штаммов V. Штаммы коллекции депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб. Полученная информация о наличии или отсутствии в геноме 4 природных штаммов различных генов будет использована для геномной паспортизации штаммов из Государственной коллекции патогенных бактерий Микроб. Штаммы V. ОтрТ, а также чувствительности к холерным диагностическим эльтор и классическим бактериофагам. Вместе с тем предпандемическне штаммы имеют выраженные отличия от пандемических относительно их резистентности к изученным антибиотикам. В геноме авирулентиых и вирулентных предпандемических штаммов присутствуют общие структурные , x, и регуляторные x, x, i, , рерА гены, а также, остров нерсистснции в окружающей среде ЕР1. Предпандемическне штаммы способны образовывать биоиленку, что связано с эффективной экспрессией генов, контролирующих подвижность , биосинтез экзополисахарида и маннозочувствительных пилей адгезии , последние из которых входят в состав I. Окружающая среда и здоровье Суздаль, г. По теме диссертации опубликовано научных работ, из них 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающею 9 нитруемых работ, из них отечественных и 5 зарубежных. Общий объем диссертации составляет 3 страницу. Текст иллюстрирован таблицами и рисунками.