Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей

• Автор: Карпова, Елена Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Клеточная поверхность Архей.

I. Клеточная поверхность археи На1оЬас1епит а1тапит

1.1. Мембранные белки На1оЪас1епит 8 а1 таг шт.

1.2. Гликопротеин Бслоя клеточной поверхности На1оЬас1епит ъаИпапит.

1.2.1. Аминокислотный и карбогидратный анализ.

1.2.2. Гликозилирование.

1.2.3. Липидная модификация.

II. Клеточная поверхность микроорганизмов, относящихся к домену Эукариоты. 1. Клеточная стенка дрожжей.
1.1. Белки.
1.1.1. Белки, нековалентно связанные с клеточной стенкой дрожжей.
1.1.2. Белки, содержащие гликозилфосфоинозитольный якорь СР1 белки.
1.1.3.Белки, содержащие внутренние повторы в
аминокислотной последовательности РШбелки.
1.2. Глюкан.
1.2.1. р1,3глюкан.
1.2.2. Р1,6глкжан.
1.3. Хитин.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Используемые в работе штаммы микроорганизмов.
2. Состав сред для выращивания микроорганизмов и условия культивирования.
2.1. Среда для выращивания археи аоЬас1егтт i
2.2. Среда для выращивания дрожжей
2.3. Условия выращивания микроорганизмов.
3. Приготовление препаратов клеточных стенок
3.1. Приготовление препаратов клеточных стенок археи 1ЫоЬас1епит заЬпапит, используя постепенное понижение концентрации солей
3.2. Приготовление препаратов клеточных стенок археи НаоЬасепит ьаЬпапит
с использованием стеклянных шариков баллотини.
3.3. Приготовление препаратов клеточных стенок дрожжей с использованием стеклянных шариков баллотини.
4. Микроскопические методы.
4.1. Метод фазового контраста
4.2 Метод флуоресцентной микроскопии.
4 3. Электронная микроскопия клеток клеточных стенок дрожжей.
4.4. Электронная микроскопия клетосных поверхностей i .
5. Фракционирование белков клеточной стенки.
5 1. Получение фракции нековалентно связанных с клеточной стенкой белков.
5 2 Получение фракции ковалентно связанных с клеточной стенкой белков
6. Электрофоретические методы.
6.1. Электрофорез в денатурирующих условиях.
6.1.1. Окраска белков при помощи красителя Кумасси.
6.1.2. Окраска белков при помощи нитрата серебра.
6.2. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану
Вестернблот анализ.
7. Биотинилированис белков.
8. Получение очищенного препарата клостридиопептидазы.
8.1. Электрофорез коллагеназы в неденатурирующих условиях.
8 2. Подготовка субстрата коллагена для определения коллагенолитической активности клостридиопептидазы.
8.3. Определение коллагенолитической активности клостридиопептидазы
с помощью электрофореза в денатурирующих условиях
8 4. Определение протеолитической активности в препаратах коллагеназы по гидролизу окрашенного казеина.
9. Обработка клеточных стенок микроорганизмов протеолитическими ферментами.
9.1. Обработка клеточных стенок микроорганизмов трипсином.
9.2. Обработка клеточных стенок микроорганизмов клостридиопептидазой.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи i ii и клеточной стенки некоторых видов дрожжей.
1.1 Очистка коллагеназы ii ii с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях.
1.1.1. Проверка коллагенолитической активности полученного препарата клостридиопептидазы.
1.1.2. Проверка присутствия в очищенном препарате клостридиопептидазы протеолитической активности.
1.1.3. Определение влияния присутствия в среде инкубации на активность коллагеназы.
1.2. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи i i.
1.2.1. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных поверхностей археи i i.
1.2.2. Воздействие клостридиопептидазы на клеточные поверхности i i
1.3. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной стенки дрожжей.
1.3.1. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных стенок дрожжей.
1.3.2. Воздействие клостридиопептидазы на клеточные стенки дрожжей.
1.3.3. Сравнение состава белковых фракций клеточных стенок дрожжей vii, и i ii
1.3.4. Воздействие клостридиопептидазы на фракцию Iбелков клеточных стенок дрожжей и i i
1.3.5. Проверка чувствительности клеточных стенок дрожжей vii, и i i к протеолитической деградации использованием фермента трипсина.
1.3.6. Изучение роли Огликозилирования белков в поддержание структурной целостности клеточной стенки дрожжей.
2. Изучение роли полисахаридных компонентов клеточной стенки дрожжей в структурной организации этой органеллы клетки.
2.1. Сравнительный анализ уровня хитина в клеточной стенкие дрожжей vii, и i i.
2.2 Изучение роли глюкантрансферазы 2 в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей и vii.
2.3. Изучение структурной роли хитина в клеточной стенке дрожжей vii
2.4. Исследование морфологии двойного мутанта дрожжей vii с нарушенными генами 2 и
3. Заключение ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи i i. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных поверхностей археи i i. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной стенки дрожжей. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных стенок дрожжей. Воздействие клостридиопептидазы на клеточные стенки дрожжей. Проверка чувствительности клеточных стенок дрожжей vii, и i i к протеолитической деградации использованием фермента трипсина. Изучение роли Огликозилирования белков в поддержание структурной целостности клеточной стенки дрожжей. Изучение роли полисахаридных компонентов клеточной стенки дрожжей в структурной организации этой органеллы клетки. Сравнительный анализ уровня хитина в клеточной стенкие дрожжей vii, и i i. Изучение роли глюкантрансферазы 2 в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей и vii. Заключение ВЫВОДЫ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. Введение. Одним и важнейших компартментов клегки микроор1анизмов является клеточная поверхность II, в состав которой входит клеточная стейка КС, цитоплазматическая мембрана и, в некоторых случаях, периплазматическое пространство. КС представляет собой внешнюю часть КП Она играет роль наружного скелета клетки, выполняет защитную функцию и осуществляет комплекс взаимоотношений клетки с окружающей средой Таким образом, КС является важной и мнотфункциональной органеллой клетки, которая отражает основные особенности микроорганизма, в зависимости от условии его обитания и принадлежности к той или иной филогенетической группе Это делает КС весьма интересным объектом для изучения. Обзор литературы. I. Клеточная поверхноиь Архсй. Важным открытием в области микробиологии явилось выявление нового домена живой природы Археи Архебактерии . Следует отметить, что на филогенетическом древе рис 1 домен Археи разделен на два царства Кренархеота и Эвриархсота рис 1 Царство Крснархеота представляет собой достаточно гомогенное сообщество, включающее сравнительно узкую труппу экстремально термофильных архей. Эвриархсоты от греческою широкий включает все архейиые типы, основными из которых являются метаногены и их фенотипически близкие формы. В результате исследования особенностей жизнедеятельности и организации клеточных структур у прсдстави гелей этого домена жизни было выяснено много ин гересных с эволюционной точки зрения фактов. КП внутри домена Археи. Па основании исследования полимеров КП было построено филогенетическое древо Архей рис. Как видно на этом рисунке разные археи не обладают одним и тем же компонентом в составе клеточной стенки i, i, . Рис 1. VI . При отсутствии муреина в КП архей, ригидная КГ в грамположительных археях сформирована полимерами отличной химической природы гсевдомуреном, метанохондраитином или етерополисахаридом i, i, . Следовательно, дальнейшее, более подробное описание особенностей КП Архей целесообразно проводить на примере одною, наиболее характерного и хорошо изученного к настоящему времени представителя лого уникального домена жизни. Эвриархсоты. Клеточная поверхность археи i ii. Как известно, галофильная архея Н ii обитает в необычно соленой среде концентрация в среде составляет 4,3 М В связи с этим, важным при изучении КП эгот микроорганизма является тот факт, что 1алобактерии требуют высокие концентрации солей как для оптимального роста, так и для сохранения структурной целостности КП и стабилизации некоторых ферментов, входящих в ее состав , , Л При исследовании влияния иониои концентрации на структурную стабильность КП этих организмов выяснилось, что постепенное понижение солевой концентрации в среде роста приводило к изменению формы клеток от палочковидной к сферической. При исследовании КП . Рис. Рис 2. Схема строения клеточной поверхности археи i ii , , . ЦПМ
Рис 3. Электронная микрофотография клеточной поверхности археи НаоЬасегит ИаоЬит XI0 оескешш, Яоуп, . ЦПМ цитоплазматическая мембрана КП клеточная поверхность. Следует отметить, что в первых работах, посвященных исследованию КП Н. СИо е.