Создание новой эукариотической системы экспрессии бета-интерферона человека на основе рекомбинантного аденовируса птиц

• Автор: Черентаева, Евгения Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕННОЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕР АТУ РЫ

1.1. Вирусные системы доставки генов в клетки эукариот

1.2. Общая характеристика аденовирусов и их использование в

качестве векторов для переноса генетической информации

1.2.1. Общая характеристика и классификация аденовирусов

1.2.2. Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации

1.2.2.1. Векторы на основе аденовирусов человека

1.2.2.2. Векторы на основе аденовирусов животных и птиц

1.2.3. Аденовирус птиц СЕЬО, его особенности, использование в качестве вектора
1.3. Общая характеристика бетаинтерферона, механизмы
действия, свойства и технология получения
1.3.1. Бетаинтерферон и его функции
1.3.2. Производство бетаинтерферона.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазм и дные векторы
2.1.4. Ферменты и другие реактивы
2.1.5. Лабораторные животные
2.1.6. Лабораторное оборудование
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК
2.2.2. Выделение препаративных количеств плазмидной
2.2.3. Гидролиз ДИК специфическими
эндодезоксирибонуклеазами рестрикции
2.2.4. Обработка Фрагментом Кленова
2.2.5. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.6. Трансформация клеток Е.соН
2.2.7. Приготовление компетентных клеток
2.2.8. Приготовление электрокомпетентных клеток Е.соН
2.2.9. Гомологичная рекомбинация в Е.соН
2.2 Получение рекомбинантных аденовирусов
2.2 акопление аденовирусов
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов
2.2 Титрование вирусов
2.2 Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом
2.2 Выделение вирионной ДНК
2.2 Окраска клеток метиленовым синим
2.2 Определение биологической активности бетаинтерферона человека
2.2 Электрофорез белков в ПААГДСН
2.2 Иммуноблотинг
2.2 Дегликозилирование рекомбинантного белка бетаинтерферона человека
2.2 Количественное определение продукции белка бетаинтерферона человека методом сэндвичИФА
2.2 Выделение бетаинтерферона человека на МЫТАагарозе
2.2 Выделение бетаинтерферона человека на голубой сефарозе
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Исследование токсичности бетаинтерферона человека для
культуры клеток птиц
3.2. Получение рекомбинантных аденовирусов птиц СЕЬОИФНР
и СЕЬОИФНрЫз
3.2.1. Создание челночных плазмидных конструкций,
содержащих исходный и модифицированный ген бетаинтерферона человека в составе экспрессирующей
кассеты под контролем Vпромотора
3.2.2. Получение плазмиды, несущей геном рекомбинантного аденовируса СЕЬОИФН методом гомологичной рекомбинации в . i
3.2.3. Получение аденовируса СЕЬОИФН и СЕЬОИФНi
3.3. Продукция рекомбинантного бетаинтерферона человека i vi
3.3 Л. Экспрессия гена бетаинтерферона входящего в состав генома аденовирусов СЕЬОИФН и СЕЬОИФНi и накопление рекомбинантного белка бетаинтерферона в культуре клеток
3.3.2. Изучение динамики накопления и биологической активности рекомбинантного бетаинтерферона человека продуцируемого в культуре клеток птиц
3.4. Выделение рекомбинантного белка бетаинтерферона из культуральной жидкости методом аффинной хроматографии
3.4.1. Выделение рекомбинантного белка бетаинтерферона из культуральной жидкости на iагарозе
3.4.2. Выделение рекомбинантного белка бетаинтерферона из культуральной жидкости на голубой сефарозе
3.5. Анализ физикохимических и антигенных свойств бетаинтерферона человека, продуцируемого в клетках птиц
3.6. Продукция рекомбинантного белка бетаинтерферона человека i v
3.6.1. Продукция и накопление рекомбинантного белка бетаинтерферона человека в куриных эмбрионах, инфицированных рекомбинантным аденовирусом ИФНр
3.6.2. Изучение биологической активности бетаинтерферона продуцируемого в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов
3.7. Исследование возможности использования рекомбинантного аденовируса ИФНр для генной терапии i viv
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Ад Аденовирус
БОЕ бляшкообразующая единица
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ед. к. единица карты
т.п.о. тысяч пар оснований
ПЦР полимеразная цепная реакция
РКА репликативнокомпетентный аденовирус
ЦПД цитопатичсское действие
xi vi коксакивирусныйаденовирусный рецептор
i V1 vi 1
аденовирус птиц типа
i плазмида
фосфатный солевой буфер
ii свободный от вирусных и бактериальных контаминаций
трис гидроксиметиламинометан ЭДТА этилендиаминтеграацетат V цитомегаловирус человека открытая рамка считывания сигнал полиаденилирования ИФНР бетаинтерферон
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Производство бетаинтерферона. Выделение препаративных количеств плазмидной
2. Трансформация клеток Е. Приготовление электрокомпетентных клеток Е. Н
2. Гомологичная рекомбинация в Е. Получение плазмиды, несущей геном рекомбинантного аденовируса СЕЬОИФН методом гомологичной рекомбинации в . Актуальность проблемы. В настоящее время рекомбинантные аденовирусы Ад широко используются в молекулярнобиологических, биомедицинских и микробиологических исследованиях. Аденовирусные векторы являются удобным инструментом для исследования, например, антигенов микроорганизмов i vi и i viv, а также служат основой для разработки нового поколения генноинженерных вакцин. В последние годы разрабатывается новое направление получения рекомбинантных белков с использованием Ад векторов. При этом подходе ген целевого белка клонируют в рекомбинантный аденовирусный вектор, с помощью которого осуществляется доставка гена в эукариотические клетки для продукции белка. Большой интерес при этом вызывает возможность создания векторных систем на основе геномов аденовирусов животных и птиц. В последнее время была продемонстрирована возможность создания векторов на основе генома Ад птиц i v . Интерес к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием свойств, позволяющих предположить возможность разработки эффективной эукариотической векторной системы на его основе для продукции рекомбинантных белков i vi и i v большая пакующая емкость, более высокая физическая стабильность вирионов и способность трансдуцировать клетки птиц. Последнее свойство данного аденовируса используется для создания эукариотических систем экспрессии целевых белков на основе клеток птиц, в частности в куриных эмбрионах, которые являются хорошо изученным и безопасным объектом биотехнологии, что обеспечиваег чистоту получаемых продуктов от примесей различных патогенов. Таким образом, рекомбинантные аденовирусы могут найти широкое применение в качестве вектора для разработки новых эукариотических систем экспрессии рекомбинантных белков, в частности интерферона бета.