Симбиотические системы, формируемые инфузориями рода Paramecium и их внутриядерными бактериями : Молекулярно-генетические аспекты

• Автор: Раутиан, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.33
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 391 с. : ил

Введение

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Первые описания внутриядерных симбионтов парамеций.

2. Современное описание и диагноз рода высокоинфекционных симбионтов i

. 2.1. Морфология и жизненный цикл .

2.2. Ультраструктура .

2.3. Изменение спектра белков в жизненном цикле

2.4. Видовая и ядерная специфичность .

2.5. Транспорт в специфическое ядро

2.6. Другие внутриядерные симбионты парамеций

2.6.1. i i и С.

2.6.2. .
2.6.3. Подвижные симбионты из макронуклеуса i, ii.
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Культивирование инфузорий
1.1. Заражение неинфицированных клонов i симбиотическими бактериями.
1.2. Освобождение инфузорий от эндосимбионтов с помощью
антибиотиков
2. Методы цитологического анализа
2.1. Приготовление препаратов, окрашенных по Фельгену.
2.2. Измерение количества ДНК в ядре
. Пульсэлектрофорез
3.1. Приготовление препаратов ДНК .
3.2. Приготовление препаратов тотальной ДНК парамеций.
3.3. Приготовление маркеров молекулярной массы молекул
3.4. Обработка агарозных блоков, содержащих ДНК , крупнощепящими рестриктазами.
3.5. Условия проведения пульсэлектрофореза.
3.6. Денситометрический анализ электрокариотипов макронуклеусов парамеций.
3.7. Измерение размера молекул ДНК по данным пульсэлектрофореза
4. Молекулярнобиологические методы
4.1. Проведение гибридизации по Саузсрну
4.2. Проведение полимеразной цепной реакции.
4.3. Гибридизация на фильтрах блотгибридизация
4.4. Гибридизация i i I
5. Микроманипуляция.
6. Статистическая обработка.
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Часть I. Исследование внутриядерных симбионтов
Глава 1. Распределение внутриядерных симбионтов инфузорий по
основным систематическим группам микроорганизмов
1.1. Постановка задачи.
1.2. Результаты и обсуждение.
1.2.1. Использованные культуры.
1.2.2. Исследование
1.2.3. Другие внутриядерные симбионты парамеций
Глава 2. Исследование геномов
2.1. Постановка задачи
2.2. Результаты.
2.2.1. Использованные культуры
2.2.2. Разработка методов очистки .
2.2.2.1. Выделение и очистка , Я. и Я.
2.2.2.2. Выделение и очистка
i и Я. vi
2.2.3. Результаты исследования геномов методом пульсэлектрофореза.
2.2.3.1. Геном i.
2.2.3.2. Геном vi.
2.2.3.3. Геномы и

2.2.3.4. Геном
2.3. Обсуждение результатов
2.3.1. Линейная структура хромосомы
2.3.2. Размер генома у
2.3.3. Вариабельность геномов .
Часть II. Влияние симбионтов на ядерный аппарат хозяина.
Глава 3. Последствия инфекции, вызываемые симбионтами
микронуклеуса
3.1. Постановка задачи.
3.2. Результаты и обсуждение.
3.2.1. Зависимость результатов инфекции от концентрации инфекционных форм . Потеря .микронуклеуса на ранних стадиях заражения
3.2.2. Морфологические изменения микронуклеуса в процессе инфекции.
3.2.3. Стабильность поддержания на ранних стадиях заражения
3.2.4. Влияние на деление
микро нуклеуса.
3.2.5. Измерение количества ДНК в микронуклеусах,
освободившихся от симбионтов.
Глава 4. Последствия инфекции, вызываемые симбионтами макронуклеуса
4.1. Постановка задачи
4.2. Результаты.
4.2.1. Использованные культуры.
4.2.2. Исследование генома макронуклеуса
парамеций
4.2.2.1. Электрокариотип i .
4.2.2.2. Электрокариотипы других парамеций.
i i
i ii
ага тес i i.
i i.
4.2.3. Влияние внутриядерных эндобионтов на генетический материал макронуклеуса парамеций
4.2.4. Анализ с использованием блотгибридизации.
4.3. Обсуждение результатов.
4.3.1. Пульсэлектрофорез как новый подход к анализу геномов инфузорий
4.3.2. Влияние внутриядерных симбионтов на ядерный
аппарат парамецийхозяев
Часть III. Взаимодействие партнеров в симбиотической системе
Глава 5. Исследование специфичности симбионтхозяин в системе
i
5.1 .Постановка задачи.
5.2. Результаты
5.2.1.Использованные культуры.
5.2.2. Совместимость симбионта и хозяина
5.2.2.1. Совместимость симбионта и хозяина в системе i .
5.2.2.2. Определение стадий, на которых нарушается ход инфекционного процесса у несовместимых пар i .
5.2.2.3. Совместимость симбионта и хозяина в системе i i i.
5.2.2.4. Определение стадий, на которых нарушается ход инфекционного процесса у несовместимых пар i i i.
5.2.3. Генетический контроль устойчивости i к инфекции исследование методом трансформации
5.3. Обсуждение результатов.
5.3.1. Комплементация симбионта и хозяина. Сингснная специфичность симбиотических отношений
5.3.2. Генетический контроль инфекции хозяином
5.3.3. Молекулярные механизмы инфекционного процесса
5.3.4. Регуляция дифференцировки инфекционных форм . i.
5.4. Перспективы исследования.
Выводы.
Список литературы


Выведение симбионтов в среду, необходимое для инфекции новых хозяев и замыкающее, таким образом, жизненный цикл симбионта, происходит поразному у разных видов. У Я. Я. , Я , Я. Я. vi при делении инфицированного ядра между дочерними ядрами образуется остаточное тело, окруженное ядерной мембраной и содержащее преимущественно ИФ симбионтов Осипов, Ивахнюк, Осипов и др. Скобло и др. У И. И. i и . Каким образом происходит выведение ИФ в среду у этих видов, неизвестно i , . Из окружающей среды через цитостом ИФ попадают в пищеварительную вакуоль. Заглоченные ИФ бактерий выходят из пищеварительной вакуоли, и с током цитоплазмы попадают в непосредственную близость к ядру. Бактерия, только что попавшая в ядро, по морфологии отличается и от ИФЛи от РФ. Стадию в жизненном цикле между выходом ИФ из пищеварительной вакуоли до попадания в ядро Осипов и Подлипаев называют эуинфекционной ЭФ Осипов, Подлипаев, iv, iv, . Она почти точно соответствует активированной форме АФ iv , в терминологии Герца , i, . Как замыкается жизненный цикл , исследовано при экспериментальной инфекции новых хозяев клеточным гомогенатом, приготовленным из симбионтсодержащих парамеций Осипов, Ивахнюк, Осипов и др. Борхсениус и др. Фокин, , . В течение первых дней после инфекции популяция симбионтов в ядре представлена исключительно вегетативными формами, лишь спустя 6 Я. Я. появляются первые дифференцированные ИФ. Клеточный гомс генат из вновь зараженных культур, не содержащих ИФ, неинфекционен появление инфекционности строго коррелирует с появлением дифференцированных удлиненных, сильно преломляющих свет при наблюдении в световом микроскопе, ИФ Раутиан и др. Таким образом, было показано, что РФ лишены инфекционности, а дифференцированные ИФ инфекционны, после чего их стали называть инфекционными формами. ИФ Раутиан и др. Осипов, Подлипаев, , iv, iv, , i, iv . Ультраструктура . Все известные были изучены с применением электронного микроскопа, однако полнота изученности разных видов неодинакова. Наиболее подробно исследованы . Громов и др. Осипов и др. Громов и др. II. Осипов и др. Скобло и др. Существенно менее изучены . Борхсениус и др. Фокин, , Фокин, Сабанеева, i, v, . Ультраструктурнос сходство всех их весьма значительно. Строение оболочек типично для грамотрицательных бактерий они содержат цитоплазматическую мембрану и наружную мембрану, разделенные клеточной стенкой. Цитоплазма РФ имеет мелкозернистую структуру, содержит большое количество гранул, вероятно, рибосом. Оформленный нуклеоид отсутствует, однако наблюдаются фибриллы, возможно представляющие собой нити ДИК Громов и др. I.5. Дифференцировка ИФ проявляется, прежде всего, в гипертрофическом увеличении периплазматического пространства, которое у зрелых ИФ занимает до половины клетки и на светооптическом уровне выглядит как сильно светопреломляющая часть ИФ. Цитоплазматическая часть также претерпевает перестройку цитоплазматическая мембрана формирует многочисленные выросты, иногда образующие целую систему мембран Громов и др. На периплазматическом конце ИФ удается выявить специальную структуру кончик i, которая при электронномикроскопическом исследовании выглядит, как и периплазма, гомогенно, но более электроннопрозрачная. Он отчетливо виден и на ранних электроннограммах Осипов и др. Герц с сотрудниками . Эгу структуру i можно наблюдать и на световом уровне у выделенных симбион тов на фазовоконтрастном или интерференционном микроскопе в осмотически активной среде например, растворе сахарозы за счет заметного сжатия одного конца ИФ собственные наблюдения. Используя технику замораживанияскалывания, Виман и Герц i, , показали, что один конец ИФ вероятно, i содержит пороподобные правильно расположенные структуры. Это может объяснять его повышенную осмотическую чувствительность. Поскольку именно этим концом ИФ ориентированы к мембране пищеварительной вакуоли в момент выхода их в цитоплазму парамеции и по отношению к ядерной мембране при проникновении в ядро, этой структуре отводят важную роль в процессах внутриклеточного узнавания в ходе инфекционного процесса ii, . Осипов и др. Громов и др. Осипов и др. Громов и др. Осипов и др. Борхсениус и др.